細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢驗(yàn)與去除

1、細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢驗(yàn)與去除細(xì)菌與霉菌的污染由于環(huán)境條件差和操作不當(dāng)?shù)仍?，?？砂l(fā)生細(xì)菌和霉菌的污染。常見(jiàn)污染的細(xì)菌有革蘭陰性菌如：大腸埃希菌、枯草桿菌、假單胞菌等；革蘭陽(yáng)性菌有葡萄球菌等，真 菌污染?？砂l(fā)生，尤其炎熱、潮濕的季節(jié)十分常見(jiàn)，如煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、抱子 苗等。霉菌和細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，或產(chǎn)生有意物質(zhì)殺死細(xì)胞。鏡下可見(jiàn)腦漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從瓶壁脫落。霉菌污染容易發(fā)現(xiàn)，大 多形成白色或淺黃色菌團(tuán)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見(jiàn)，有的散在生長(zhǎng)，鏡下可見(jiàn)絲狀 菌絲，縱橫交錯(cuò)于細(xì)胞之間。細(xì)菌污染如果較嚴(yán)重時(shí)培養(yǎng)基上清混濁，較輕時(shí)鏡下可見(jiàn) 小的菌體在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)，

2、同時(shí)可涂片染色鏡檢或進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，加以確定?？股丶翱姑咕苿?duì)預(yù)防或排除細(xì)菌、霉苗污染均有效。工作中要特別注意和防止所用培養(yǎng)液和血清的污染，日前應(yīng)仔細(xì)檢查有無(wú)混濁和菌絲存在，以防止在培養(yǎng)細(xì)胞 時(shí)造成污染。支原體污染的檢測(cè)與去除2.1支原體的檢測(cè)2.1.1 PCR 法2.1.1.1原理 該法是通過(guò)PCR技術(shù)將支原體16s rRNA基因特異性擴(kuò)增，來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞 中污染的支原體。PCR引物選自16s rRNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細(xì)菌 的序列無(wú)交叉性雜交反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)漠乙啶（EB）染色后在紫外透 射儀上進(jìn)行檢測(cè)。*16s r DNA引物用水稀釋至40gmo

3、l/Lo（1）正向引物：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA3（2）反向引物：5-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3*質(zhì)粒pBR322引物用水稀釋至40gmol/L.（1）正向引物：5-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT3（2）反向引物：5-AGCGCAAGCGGAGTCAGTGAGC-3*裂解緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH8.3）, 50mmol/L KCL，2.5mmol/L MgCl2, 5g/L Tween20 和 5g/L TritonX-100o*蛋白酶K （proteinase K）貯存液：蛋白酶K 20 mg/mL溶于5

4、0%甘油中，于一20C貯存。*耐熱DNA聚合酶（如Taq聚合酶）與相應(yīng)的10XTAE緩沖液*瓊脂糖（分子生物學(xué)級(jí)）；EB （10mg/mL溶于水中并避光保存）。*6x加樣染液（40%甘油、0.125% 漠酚藍(lán)和125mmol/L EDTA）.*DNA 分子量標(biāo)志（50ng/mL）、pBR322 DNA。*PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、微波爐、電泳裝置、紫外透射儀（UV）、加樣槍、PCR管（0.5mL 或 0.2mL）。2.1.1.2方法與步驟1）樣品制備（1）將106細(xì)胞懸液或貼壁細(xì)胞刮下來(lái)的懸液放1.5mL微離心管內(nèi)，以最大轉(zhuǎn)速離心 15mino（2）棄去上清，將細(xì)胞再懸浮于100叫裂解液中，然后加

5、蛋白酶K，使終濃度為60gg/mLo（3）置微波爐內(nèi)60C孵育1h，然后升至95C 10min，再將樣品置室溫中降溫。2）PCR擴(kuò)增（1）在冰浴中對(duì)各樣品制備PCR重要混合物，對(duì)每個(gè)樣品均加入：10XPCR 緩沖液 5.0 mL25mmol/L dNTPs 混合物 0.卻140gmo1/L 16sr DNA 引物 每種引物 1.0g140gmo1/L pBR322 DNA 引物 每種 2.0皿pBR322 DNA 1pg/mL 2.0g1DNA 聚合酶(5U/mL) 0.21三蒸水35.43總量45g1用無(wú)菌去離子水稀釋樣品為1:10, 1:100。于每個(gè)eppendorf管中加45g1 PC

6、R擴(kuò)增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100 稀釋液各51，操作均在冰浴中進(jìn)行。在每個(gè)eppendorf管中輕輕加入501無(wú)菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴(kuò)增儀帶 有有制式熱蓋，此步驟可省略。將各管放入DNA擴(kuò)增儀的孔槽內(nèi)，并執(zhí)行以下循環(huán)指令：95 C 10min 一個(gè)循環(huán)；95C，30S 一 58C 1min 一 72C 1min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72C 10min延長(zhǎng)循環(huán)。3) PCR產(chǎn)物分析制備含有EB染料(0.1pg/mL)的1%瓊脂糖凝膠(用TAE緩沖液制備)從PCR擴(kuò)增儀中取出樣品管，取10g1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到21帶有染液的加樣液中， 混勻后加樣到瓊脂糖凝膠

7、加樣孔中，同時(shí)在對(duì)照孔中加101標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量標(biāo)志。凝膠置TAE緩沖液中，電壓80V，電泳60-90min。凝膠電泳完畢，將凝膠置紫外透射儀下觀察，有無(wú)被EB染料著色的紅色熒光DNA條 帶，樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)DNA孔進(jìn)行比較并拍照。2.1.1.3質(zhì)控與提示陽(yáng)性對(duì)照如果支原體DNA可查到，則10ngDNA即呈陽(yáng)性結(jié)果。如得到已知支原體感染的細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞可同樣品一樣處理，作為陽(yáng)性對(duì)照，處理的 細(xì)胞置一20C凍存，可重復(fù)使用。陰性對(duì)照用45g1 PCR擴(kuò)增液加51無(wú)菌去離子水混勻，作為陰性對(duì)照。在含45g1 PCR擴(kuò)增液的eppendorf管中建立一個(gè)對(duì)照孔，以21無(wú)菌去離子水替代 pBR322 DN

8、A(1pg/mL)。有時(shí)樣品中可能含有聚合酶的抑制物，可阻抑PCR擴(kuò)增，這種情況很易被pBR322擴(kuò) 增片段的缺失所識(shí)別。遇此情況是，應(yīng)從同一培養(yǎng)物中另取少量細(xì)胞(105個(gè))重新制備一 份樣品，如果這樣做仍無(wú)擴(kuò)增片段出現(xiàn)，就將細(xì)胞在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中試生長(zhǎng)2-3周， 然后再作支原體檢測(cè)。因?yàn)榭股啬芙Y(jié)合雙鏈DNA,故有人懷疑抗生素具有抑制Taq聚合 酶的活性。2.1.2 DNA熒光染色法2.1.2.1 原理DNA熒光染色法是以Hoechst或4 / -6-二氨基-2苯基吲哚(4 / -6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)試劑為熒光染料，使支原體DNA著色，用熒光顯微

9、鏡 在感染的靶細(xì)胞的胞質(zhì)中辯認(rèn)出熒光，證明試驗(yàn)樣品中存有支原體。2.1.2.2試劑與儀器*靶細(xì)胞 CKI1 (IFO5003，JCRB0008)或 Vero 細(xì)胞(ATCC CCL82)*試驗(yàn)樣品約106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液1mL*支原體 mycoplasma hyorhinis (ATCC 29052) M.orale(IFO 14477)*培養(yǎng)液MEM+10%FBS (無(wú)抗生素)無(wú)鈣鎂PBS固定液；甲醇：醋酸為3 : 1 *熒光染液濃縮染液：100mLPBS中加Hoechst Dye 5mg防腐劑thimerosal 10mg用磁力攪拌器助溶 30min，每瓶分裝1mL,嚴(yán)格避光保存于一20

10、C冰箱內(nèi)使用液:將凍存的濃縮液取0.15mL加入100mLPBS中，(最終濃度為0.075pg/mL的Hoechst Dye 0.15gg/mL的thomerosal防腐劑)用磁力攪拌器攪拌助溶30min,使色素完全溶解。(使 用前調(diào)制)*熒光顯微鏡、各種吸管、60mm玻璃平皿、10mL離心管、4個(gè)帶有可活動(dòng)玻片的培養(yǎng)皿、 蓋玻片(無(wú)熒光)2.1.2.3方法與步驟檢驗(yàn)材料的制備檢體細(xì)胞的培養(yǎng)：被檢細(xì)胞在不含有抗生素的培養(yǎng)中傳代培養(yǎng)3次以上(不低于3次) 在最后一次傳代培養(yǎng)增殖期中換新鮮培養(yǎng)液，經(jīng)2-3天培養(yǎng)。細(xì)胞回收：培養(yǎng)細(xì)胞上清液，以及用橡膠刮匙從培養(yǎng)皿上刮上的細(xì)胞，吸入離心管內(nèi)，于 4C下

11、，1200r/min，離心10min。吸棄上清，留下約含106個(gè)及大約1mL上清液。凍融：將離心細(xì)胞收集到凍存管內(nèi)置一20C凍結(jié)，30min后置37C孵箱內(nèi)融解，如此反 復(fù)操作2次，于4 1200r/min C離心10min，吸取上清液作為檢體。標(biāo)記靶細(xì)胞培養(yǎng)與檢體的接種將液氮(一196C )凍存的CKI-1或Vero細(xì)胞解凍(37 1 C分鐘內(nèi)迅速解凍)計(jì)數(shù)活 細(xì)胞達(dá)2-3x103/mL，植入4個(gè)帶有可活動(dòng)的切片在皿底的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿1mL， 置CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。孵育24h后在顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈適當(dāng)?shù)拿芏?高倍鏡下見(jiàn)160-240個(gè)細(xì)胞/視野)時(shí)， 棄去培養(yǎng)液，于每個(gè)帶可活動(dòng)切片平皿內(nèi)換新

12、鮮培養(yǎng)液0.9mL，在i號(hào)皿內(nèi)接種凍融檢體 0.1mL在ii號(hào)皿內(nèi)加0.1mL培養(yǎng)液，作為陰性對(duì)照，iii與iv號(hào)皿內(nèi)加入100cfu/0.1mL的 M.hyorhinis和M.orale支原體液，作為陽(yáng)性對(duì)照。將4個(gè)培養(yǎng)皿置CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)6天。細(xì)胞固定、染色、封片觀察吸棄培養(yǎng)液，用CMF-PBS洗滌細(xì)胞加在可活動(dòng)玻片上1mL固定液，固定10min。吸棄固定液，風(fēng)干后各加染色液，置室溫染色30min。吸棄染色液，用蒸餾水洗3次，取下可活動(dòng)玻片的杠架和墊圈，取下可活動(dòng)玻片。滴入封片液，其上復(fù)上蓋玻片并趕除氣泡和多余的封片液，四周用封片膠封閉。啟動(dòng)紫外系統(tǒng)，用熒光顯微鏡觀察(放大約X400-60

13、0適宜)結(jié)果判定在細(xì)胞質(zhì)中觀察有無(wú)熒光，試驗(yàn)樣品與陽(yáng)性、陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)觀察。計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，有5個(gè)以上的細(xì)胞質(zhì)中見(jiàn)熒光著色，可判定為陽(yáng)性。2.1.2.4質(zhì)控與提示標(biāo)記的靶細(xì)胞除CKI-1和vero細(xì)胞外，3T6細(xì)胞(ARCCCCL96)也可使用。本法 成功的要點(diǎn)之一是用作靶細(xì)胞質(zhì)控的管理應(yīng)嚴(yán)格，必預(yù)先確認(rèn)該細(xì)胞無(wú)支原體的污染才能凍 存使用。要明確本檢體的結(jié)果判定，必須使用不含抗生素的培養(yǎng)液。染色液：Hoechst染液不穩(wěn)定，故每次檢測(cè)前須新鮮配制，使用DAPI也可以，均應(yīng) 新鮮配制。試驗(yàn)檢體：被試細(xì)胞回收時(shí)用橡膠刮匙刮下，不能用胰蛋白酶等水解酶類消化，制備 好的檢體細(xì)胞保存在一80C冰箱中可

14、存放數(shù)月。陽(yáng)性對(duì)照：本試驗(yàn)采用支原體M.hyorhinis和M.orale為陽(yáng)性對(duì)照，要十分注意避免 有新的污染源。特異性與敏感性：本法不是支原體的特異性檢出法，對(duì)DNA進(jìn)行染色觀察，對(duì)其他 微生物(細(xì)胞內(nèi)寄生的霉菌、細(xì)菌等)的污染，也可看出同樣的熒光染色，甚至檢體會(huì)含有 細(xì)胞的DNA顆粒，都是引起結(jié)果判定混亂的原因。但細(xì)胞培養(yǎng)所污染的支原體， M.hyorhinis、M.orale、M.salivarim、M.hominis、M.fermentans 等約占支原體污染的 97%， 本法針對(duì)這些支原體污染的檢出敏感度為1cfu，而一般污染細(xì)胞中的支原體濃度為103 一 108cfu/mL，故本

15、法仍具有很好的實(shí)用性。2.2支原體的去除由于支原體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的交叉污染嚴(yán)重并在無(wú)意識(shí)之中發(fā)生，故對(duì)支原體檢測(cè)為陽(yáng)性的 細(xì)胞株應(yīng)丟棄；只對(duì)某些貴重的細(xì)胞株而言，才設(shè)法去除支原體。常用方法有藥物法、免疫 法、稀釋法、加熱法等。從感染的細(xì)胞系中去除支原體較簡(jiǎn)單的方法是用阻礙支原體DNA 或RNA合成的抗支原體類抗生素處理細(xì)胞。普遍的抗生素在細(xì)胞培養(yǎng)液中對(duì)支原體是無(wú)效 的。而用于去除支原體的藥物均為喹諾酮類和/或四環(huán)素類抗生素的衍生物。2.2.1試劑與儀器*抗支原體藥物：四環(huán)素與截短側(cè)耳素的復(fù)合物(BM-cyclin)；卡那霉素、二甲胺四環(huán)素與 肌胝素協(xié)同使用，氟代喹諾酮類抗生素等，已有成品供應(yīng)。*細(xì)

16、胞培養(yǎng)基：25cm2組織培養(yǎng)瓶*金屬通風(fēng)櫥、CO2孵箱、離心機(jī)等2.2.2方法與步驟藥物法細(xì)胞的去除支原體處理支原體污染的細(xì)胞以105個(gè)細(xì)胞/mL (25cm2培養(yǎng)瓶中約10mL)接種于常規(guī)培養(yǎng)基 并加有抗支原體藥物，藥物濃度為理論(想)值IC50。，即采用510倍于常用量的沖擊法。培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)液，恢復(fù)原先處理，并在1周內(nèi)重復(fù)同樣的處理。培養(yǎng)1周后，將細(xì)胞接種于常規(guī)培養(yǎng)基內(nèi)。常規(guī)培養(yǎng)2周后，用前法所述檢測(cè)細(xì)胞有無(wú)支原體污染，如果無(wú)支原體檢出，則重復(fù) 實(shí)驗(yàn)。2至3周后再次檢測(cè)以確定該結(jié)果，經(jīng)這樣處理的細(xì)胞認(rèn)為是無(wú)支原體污染的。免疫法要用抗支原體抗體或人及動(dòng)物血清中的補(bǔ)體與污染細(xì)胞株于體

17、外培養(yǎng)。支原體結(jié)合并裂 解破壞支原體?；蛴脛?dòng)物接種法將污染支原體的腫瘤細(xì)胞接種于同種系動(dòng)物皮下或腹腔，或 接種于裸鼠腹腔，利用動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)殺傷支原體。克隆法克隆法即有限稀釋法。將污染支原體的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，接種于96孔培養(yǎng)板，使之 每孔只接種一個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行克隆培養(yǎng)，經(jīng)前法檢測(cè)，挑取無(wú)支原體污染的細(xì)胞克隆，這種方 法對(duì)污染較輕的細(xì)胞株效果好。加熱除去根據(jù)支原體對(duì)熱耐受性較差的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞置于41C中作用510h，最 長(zhǎng)可達(dá)18h，以殺滅支原體，但41C對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞本身也有傷害，故在處理前應(yīng)欲試驗(yàn)摸好條 件。另外有人利用軟瓊脂技術(shù)，經(jīng)50C加熱(46min)滅活污染細(xì)胞的支原體，

18、再于37C 培養(yǎng)13天，使瓊脂中抗生素與支原體進(jìn)一步作用，使熱滅活的支原體徹底被清除。內(nèi)毒素污染的檢測(cè)與去除3.1內(nèi)毒素含量測(cè)定3.1.1原理本法應(yīng)用鱟變形細(xì)胞溶解物(limplus amoebocyte lysate， LAL) LAL來(lái)檢測(cè)和 /或定量革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，稱鱟試驗(yàn)，鱟試驗(yàn)的機(jī)制是內(nèi)毒素活化LAL中前凝固 酶而使凝固蛋白原變不凝固蛋白，使LAL出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝膠從而可定量測(cè)知內(nèi)毒素的含 量。3.1.2試劑和材料*待測(cè)樣品*用入表示鱟試劑的敏感性單位（例如，人=0.125EU/mL）（有商業(yè)成品）對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）（有商業(yè)成品）不含內(nèi)毒素的水（即LAL水）（有商業(yè)成品

19、）*硼硅酸鹽制，錐形終末反應(yīng)試管（內(nèi)徑10mm，長(zhǎng)75mm）（內(nèi)毒素測(cè)定專用，有商業(yè)成品）*不含內(nèi)毒素的氫氧化鈉（0.1mol/L）*不含內(nèi)毒素的鹽酸（0.1 mol/L）*末被內(nèi)毒素污染的硼硅酸玻璃制成的稀釋用試管。*指示溫度計(jì)*371C恒溫水浴箱。*200和10001的微量移液管有未被內(nèi)毒素污染的管頭。*無(wú)內(nèi)毒素吸管（10、5、2和1mL）*PH計(jì)或PH試紙*螺旋攪拌器*能夠保持250 1 C小時(shí)的干烤箱。*聚膜（parafilm）3.1.3方法與步驟測(cè)定內(nèi)毒素水平需要進(jìn)行兩步（1）確定LAL試劑的敏感度（2）檢測(cè)待測(cè)樣品中是否 存在可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的干擾因素。確證鱟試劑的敏感度（1）根

20、據(jù)CSE的初濃度，用LAL水將CSE連續(xù)二倍比稀釋，稀釋后的濃度為2人，1入， 0.5入，0.25例如，如果入=0.125EU/mL，則濃度分別為 0.25, 0.125, 0.0625 和 0.0312EU/mL）（稀釋管的體積是0.1mL）（2）將各0.1mLCSE稀釋液轉(zhuǎn)移到錐形末反應(yīng)管中，然后向各管中加入0.1mL的LAL試 劑。（3）用封口膜封閉管口并輕輕混勻。（4）371C下孵育60分鐘，輕柔地倒置試管（180），不要振蕩，觀察結(jié)果。當(dāng)內(nèi)容物形成堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒置試管后，凝膠仍然附著在管底，該結(jié)果為陽(yáng)性。在每組 稀釋液中，具有最低稀釋濃度的CSE稀釋液應(yīng)呈陰性結(jié)果，如果均呈陽(yáng)性結(jié)果，

21、應(yīng)提高稀 釋倍數(shù)，再進(jìn)行試驗(yàn)。（5）測(cè)定的終點(diǎn)是每組稀釋液中最后出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的稀釋液的濃度。GEP=10m，m=e/f，其中e為各組稀釋液的終點(diǎn)的log值的總和，f為稀釋液的組數(shù)。 如果計(jì)算出的GEP介于0.5入與2 之間，可確證鱟試劑的敏感度。對(duì)干擾因素的檢測(cè)（1）用待測(cè)樣品將CSE稀釋成上述終濃度。（2）測(cè)定混合液的pH值，并用不含內(nèi)毒素的NaOH或HCL將該混合液的pH值調(diào)至 6.5-7.5。（3）重復(fù)上述測(cè)定GEP的發(fā)驟，計(jì)算GEP值。如果GEP值介于0.5入和2入之間，則樣 品中不包含干擾因素。否則，提高樣品的稀釋倍數(shù)，重復(fù)測(cè)定。對(duì)樣品的定量測(cè)定A：準(zhǔn)備兩試管，分別盛濃度為2入和0.

22、5入的CSE。(0.1mL，用LAL水二倍比稀釋)B：用LAL水將樣品稀釋，準(zhǔn)備兩組樣品稀釋液。(終體積為0.1m1，二倍比稀釋)C：用LAL水作為陰性對(duì)照。(0.1m1)D：向樣品中加入CSE至CSE濃度為2人，以此作為指示樣品中是否含有干擾因素的對(duì)照(0.1m1)重復(fù)前述步驟，向各管中加入0. 1m1的LAL試劑。如果實(shí)驗(yàn)有效，則必須：呈陰性結(jié)果(排除因試劑中含有內(nèi)毒素而導(dǎo)致假陽(yáng)性)呈陽(yáng)性結(jié)果(排除干擾因素)確證了細(xì)胞溶解產(chǎn)物的敏感度。樣品內(nèi)毒素濃度：入xB的終點(diǎn)。3.1.4質(zhì)控與提示對(duì)于一般性的內(nèi)毒素，可用CSE代替較貴的參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(RSE)，使用時(shí)將CSE 和BSE對(duì)比校正。使用前，劇烈振蕩CSE，使其懸浮。輕柔振蕩鱟試劑使其懸浮，避免起泡。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在空氣不流動(dòng)的房間里，無(wú)菌的操作臺(tái)上進(jìn)行，使用末被內(nèi)毒素污染的材料。3.2內(nèi)毒素的去除3.2.1原理本法用于去除實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上的內(nèi)毒素。將玻璃器皿置于烤箱中，加熱到250 r，持續(xù)30min，即可去除內(nèi)毒素。3.2.2方法與步驟內(nèi)毒素去除效率的評(píng)估制備濃度分別為1000