細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 周立軍細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院參考書目細(xì)胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004年參考書目細(xì)胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年本次課內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)一、緒論 培養(yǎng)法的種類、培養(yǎng)法的發(fā)展、細(xì)胞培養(yǎng)的常用術(shù)語、培養(yǎng)細(xì)胞的作用及意義、培養(yǎng)法的應(yīng)用二、培養(yǎng)細(xì)胞的特征 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型、 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程、 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素本次課內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)一、緒論一、緒論一、緒論細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 即：從活體中取出小塊組織分離出

2、細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。涉及有細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)與植物學(xué)、病原學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、生物工程學(xué)甚至光學(xué)、物理學(xué)等等學(xué)科。因其涉及面很廣所以已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（tissue culture）： 其本意是指從體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（tissue culture）：器官培養(yǎng)（Organ culture

3、）： 指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法，以上三個(gè)層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（in vitro）。器官培養(yǎng)（Organ culture）：培養(yǎng)法的種類體外培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)法的種類體外培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)體外培養(yǎng)種類體細(xì)胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。群體培養(yǎng)（mass culture）：即將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長，形成均勻的單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液?？寺∨囵B(yǎng)（clone culture）：即將少數(shù)細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過繁殖每一

4、個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆。細(xì)胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，個(gè)別集落形成，細(xì)胞圍繞中心漩渦狀排列100原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，個(gè)別集落形成，細(xì)原代培養(yǎng)第7天，多個(gè)集落形成并融合100 原代培養(yǎng)第7天，多個(gè)集落形成并融合100 培養(yǎng)法的發(fā)展組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。德國人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存活數(shù)月被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗(yàn)。1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞生活一個(gè)月，提示組織或細(xì)胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍

5、能生存。發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。哈里森（生理學(xué)家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓節(jié)段在淋巴液中進(jìn)行培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察到從神經(jīng)芽細(xì)胞延伸出神經(jīng)軸突的狀況。建立起一套合理的無菌培養(yǎng)技術(shù) 哈里森懸滴培養(yǎng)法發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。發(fā)展簡史哈里森懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)物凝固的淋巴凹玻片槽蓋玻片將蛙胚原始脊髓節(jié)段，移到事先滴有從成體蛙淋巴囊吸取的新鮮淋巴的蓋玻片上，淋巴很快凝固，使組織小塊固定在一定的位置上。然后將蓋玻片倒置于一塊中央凹陷的厚載玻片上，蓋玻片的周緣用蠟封固。蛙胚神經(jīng)組織存活了數(shù)周體外培養(yǎng)組織和細(xì)胞的

6、基本模式系統(tǒng)。發(fā)展簡史哈里森懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)物凝固的淋巴凹玻片槽蓋玻片將蛙胚原始脊髓卡氏瓶的發(fā)明Carrel用反復(fù)傳代的方法使細(xì)胞系存活34年。他采用的無菌技術(shù)，以及后來設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是對(duì)組織培養(yǎng)的重要貢獻(xiàn)。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。發(fā)展簡史卡氏瓶的發(fā)明Carrel用反復(fù)傳代的方法使細(xì)胞系存活34年。組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖 1923年，Carrel設(shè)計(jì)了卡式瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織的生存空間。1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染。發(fā)展簡史組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖 1923年，Carrel設(shè)計(jì)了卡式瓶培養(yǎng)1957年Dulbe

7、cco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了的單層細(xì)胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)成了組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。促進(jìn)了細(xì)胞系(cell line)的建立。近年各種條件已商品化系列化，應(yīng)用冷凍技術(shù)，各國建立細(xì)胞庫 發(fā)展簡史1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體我國組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀(jì)30年代傳入我國。20世紀(jì)50年代起步。20世紀(jì)70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中應(yīng)用的手段。我國組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀(jì)30年代傳入我國。組織培養(yǎng)常用術(shù)語 原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)（passage culture）：將細(xì)胞

8、以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 注：傳代（passage，subculture）組織培養(yǎng)常用術(shù)語 原代培養(yǎng)（primary cultur原代培養(yǎng)胎兒細(xì)胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞比較容易，上皮細(xì)胞培養(yǎng)難。細(xì)胞間的分離酶：胰蛋白酶、膠原酶、單一種類細(xì)胞的分離培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基、細(xì)胞接著面的條件、接著速度、離心法等。術(shù)語原代培養(yǎng)胎兒細(xì)胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。細(xì)胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培

9、養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的特殊性質(zhì)或標(biāo)志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物。克?。╟lone）：指單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳性狀相同的細(xì)胞群體。術(shù)語細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)有分化特性的細(xì)胞系和細(xì)胞株組織來源細(xì)胞系增殖性物種分化特性脾Friend永生小鼠合成血紅蛋白Morris肝癌HTC永生 大鼠酪氨酸轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)髓性白血病K562永生人合成血紅蛋白垂體瘤GH2,GH3永生大鼠產(chǎn)生生長激素黑色素瘤B16永生小鼠產(chǎn)生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白膠質(zhì)瘤CCM永生人膠質(zhì)纖維酸性蛋白成神經(jīng)細(xì)胞瘤C1300永生大鼠生長軸突有分化特性的細(xì)胞系和細(xì)胞株組織來源細(xì)胞系增殖

10、性物種分化特性脾對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：1、活細(xì)胞： 能長時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)；2、可控制： 選擇對(duì)象：均一性、重復(fù)性（類型、性質(zhì)、階段） ； 調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學(xué)、生物等因素）； 利用方法：研究技術(shù)、記錄方法；3、應(yīng)用廣： 領(lǐng)域多：醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、基因工程等 對(duì)象廣：各種動(dòng)物（低等動(dòng)物-高等動(dòng)物-人類） 一種動(dòng)物（不同年齡、不同組織） 正?；虍惓＃[瘤）4、較經(jīng)濟(jì)： 可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)： 1、培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生改變； 2、對(duì)人員、設(shè)備等要求較高。與體內(nèi)主要不同 相對(duì)孤立、相對(duì)單一、缺乏

11、體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱、細(xì)胞趨向單一化。 提示 要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià)缺點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究、觀察內(nèi)容細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)：例如能量的代謝、DNA轉(zhuǎn)錄、凋亡及蛋白合成等。細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間的作用：如細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)、藥物對(duì)細(xì)胞的作用、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌等。細(xì)胞間的相互作用：如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞間的粘著作用、接觸抑制、密度抑制等。細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、鈣離子的流動(dòng)、RNA的移動(dòng)、激素受體復(fù)合物的易位等。遺傳學(xué)：如遺傳分析、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

12、的研究、觀察內(nèi)容細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)：例如能量的代謝、DN細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域 （一）、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用 （二）、在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 （三）、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 （四）、在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 （五）、在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用 （六）、在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用 （七）、在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用 （八）、在器官移植中的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域 （一）、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用病毒檢驗(yàn)方法病毒學(xué)病毒培養(yǎng)全程5-30天細(xì)胞病變判定熒光染色：1. 病毒涂片2. 血清型專一 抗體熒光染色中和試驗(yàn)：培養(yǎng)出的病毒與血清型專一性抗血清作用，再接種至細(xì)胞病毒培養(yǎng)：1.細(xì)胞培養(yǎng)2.接種至細(xì)胞病毒檢驗(yàn)方法病毒學(xué)病毒培養(yǎng)全程5-30天細(xì)

13、胞病變判定熒光染色檢測病毒 C P E正常細(xì)胞病變細(xì)胞檢測病毒 C P E正常細(xì)胞病變細(xì)胞雜交瘤技術(shù)Hybridomas免疫學(xué)脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命Khler和Milstein, 19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)雜交瘤技術(shù)Hybridomas免疫學(xué)脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)模化培養(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫 細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選) 分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡 無限生長細(xì)胞 分泌X抗體

14、只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c單克隆抗體制備免疫學(xué)培養(yǎng)上清中X抗體的檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2、 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)3、基因診斷和基因治療在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化器官移植組織工程種子細(xì)胞（干細(xì)胞）支架材料器官移植組織工程種子細(xì)胞（干細(xì)胞）組織工程組織工程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、培養(yǎng)細(xì)胞的基本特征 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素二、培養(yǎng)細(xì)胞的基本特征 培養(yǎng)細(xì)胞的

15、生長方式和類型（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才 能生長的細(xì)胞。 如：成纖維細(xì)胞、心肌與平滑肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 如：血、脾及骨髓培養(yǎng)的細(xì)胞及某些癌細(xì)胞 （一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持粘附型（貼壁型）細(xì)胞 粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí) 明顯不同。粘附型（貼壁型）細(xì)胞 粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)

16、胞在體內(nèi)生存和粘附型細(xì)胞 體外培養(yǎng)下，形態(tài)異?？煞从称渑邔悠鹪?，按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，可分為幾大類型： 成纖維型細(xì)胞 上皮型細(xì)胞 游走型細(xì)胞 多形型細(xì)胞粘附型細(xì)胞 體外培養(yǎng)下，形態(tài)異?？煞从称渑邔悠鹪矗凑粘衫w維型細(xì)胞上皮型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細(xì)胞，如：成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。 形態(tài)：類似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不等的突起，中央有卵圓形核。生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀生長。成纖維型細(xì)胞來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細(xì)胞，如：成纖維細(xì)胞上皮型

17、細(xì)胞來源：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如：皮膚及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性腫瘤等。形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，呈扁平、不規(guī)則、多角形，中有圓形核。生長特點(diǎn)：細(xì)胞緊密相連成單層膜 相靠緊密相連成薄層鋪石狀 上皮型細(xì)胞來源：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如：皮膚及其衍生物、 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而發(fā)生改變，如pH、細(xì)胞密度、污染等因素。 HeLa細(xì)胞： 血清 高血清成纖維樣細(xì)胞 低血清上皮樣細(xì)胞 pH 標(biāo)準(zhǔn)pH上皮樣細(xì)胞 太酸或太堿成纖維樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 低密度成纖維樣細(xì)胞 高密度上皮樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化成纖維樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化后上皮樣細(xì)胞粘附型細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而

18、發(fā)生改細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮型細(xì)胞 概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長。 來源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞為主。 特點(diǎn)：在懸浮中生長良好，細(xì)胞圓形，呈單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)。 懸浮型細(xì)胞 概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以 優(yōu)點(diǎn)： 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)： 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)懸浮型細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)： 生存空間大，提供數(shù)量大懸浮型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn) 粘附并伸展 是大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)。細(xì)胞在接種后很快便可見到細(xì)胞伸出偽足附著，與支

19、持物形成一些接觸點(diǎn)，接著細(xì)胞逐漸呈扁平或放射狀伸展，逐漸形成上皮型或成纖維型或其他類型生長。 密度依賴性 細(xì)胞接種密度過高或過低都會(huì)影響細(xì)胞的生長、增殖。當(dāng)細(xì)胞粘附生長、融合成單層時(shí)，細(xì)胞變得較為擁擠，而扁平形狀的程度減少，與培養(yǎng)基的接觸面減少，同時(shí)，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物逐漸消耗，細(xì)胞分裂減弱，增殖減慢。培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn) 粘附并伸展二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle）細(xì)胞系的生長過程培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cy單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle）生長增殖過程MG1SG2間期DNA合成期前中后末有絲分裂期單個(gè)

20、細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle）生長增殖過程MG組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期原代培養(yǎng)期傳 代 期衰 退 期組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 又稱初代培養(yǎng)期 （primary culture），從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。 此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛；細(xì)胞形態(tài)相似。 細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。原代培養(yǎng)期 又稱初代培養(yǎng)期 （primary cult傳代培養(yǎng)期初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系cell line。此期為三期中最長，可維持二倍體核型（二倍體細(xì)胞系）。當(dāng)傳代3050代后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。

21、衰退期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。傳代培養(yǎng)期體外培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長過程體外培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長過程第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線 接觸抑制（contact inhibition）：貼壁生長的體外正常細(xì)胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進(jìn)入S期，也不會(huì)出現(xiàn)交叉重疊生長。 惡性細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，所以可將其作為區(qū)別正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。 密度抑制（density inhibition）：培養(yǎng)液營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。培養(yǎng)細(xì)胞生長過程中的特點(diǎn) 接

22、觸抑制（contact inhibition）：貼壁 傳代細(xì)胞可連續(xù)傳710代，細(xì)胞形狀基本相同，但隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞逐漸呈老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為:細(xì)胞增殖速度明顯減慢，胞漿中出現(xiàn)空泡及顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，失去貼壁能力，從培養(yǎng)瓶底脫落。 傳代細(xì)胞可連續(xù)傳710代，細(xì)胞形狀基本相同，但隨三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件 水高度純化 糖葡萄糖 氨基酸12種 維生素 無機(jī)離子和微量元素 促生長因子三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件 水高度純化各種培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血清添加蛋白半合成培養(yǎng)基添加蛋白合成培養(yǎng)基無蛋白合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血

23、清添加蛋白細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)血 清 血清的種類 血清的主要成分及主要作用 血清的使用與儲(chǔ)存 影響血清的各種因素 細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)血 清 血清的種類1、血清的種類 胎牛血清：剖腹產(chǎn)的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之內(nèi)的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛 （人血清、馬血清、羊血清）2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長活性是達(dá)到生理平衡的。1、血清的種類A因子：能促進(jìn)細(xì)胞早期生長，縮短潛伏期，清除細(xì)胞內(nèi)脂肪滴。B因子：是一種脂肪形成劑，易使細(xì)胞產(chǎn)生脂肪滴，

24、其本身是可溶性脂類。 B因子在老年血清中含量較多， 過濾可除去該因子。C因子：可使細(xì)胞發(fā)生退化。D因子：可促使細(xì)胞粘連，是一種粘著 因子。去除B、C因子，可促進(jìn)細(xì)胞生長A因子：能促進(jìn)細(xì)胞早期生長，縮短潛伏期，清除細(xì)胞內(nèi)脂肪滴。去細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)血清的主要作用 提供基本營養(yǎng)物質(zhì) 提供貼壁和擴(kuò)展因子（FN、LN） 提供激素及各種生長因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細(xì)胞障礙因素） 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用注意點(diǎn)： 血清型號(hào)、種類不同，所含營養(yǎng)因素有差別，不可忽視； 在需要觀察細(xì)胞某種特性時(shí)，血清使問題變復(fù)雜，要除去。 血清的主要作用 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)血清

25、的使用與儲(chǔ)存 使用前的處理 56滅活30min 去除補(bǔ)體成分 （趨勢：大部分細(xì)胞培養(yǎng)不需滅活； 需要滅活的：巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等） 儲(chǔ)存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲(chǔ)存；使用前4 融化。 使用濃度 一般為520，最常用的是10。血清的使用與儲(chǔ)存 使用前的處理影響血清的各種因素 年齡：較老動(dòng)物的血清對(duì)細(xì)胞生長有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對(duì)細(xì)胞生長有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好影響血清的各種因素 年齡：較老動(dòng)物的血清對(duì)細(xì)胞生長有抑細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn) 使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)

26、。 如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，同時(shí)會(huì)抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn) 使用血清有可能改變某種細(xì)胞在影響細(xì)胞生長的因素 溫度 滲透壓 氣體環(huán)境和pH 無毒和有毒 輻射線和超聲波 細(xì)胞接種密度 容器轉(zhuǎn)動(dòng)速度和懸浮攪動(dòng)速度影響細(xì)胞生長的因素 溫度溫 度 一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度3738，溫度過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞的生長。溫度對(duì)細(xì)胞生長的影響溫 度 一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫低 溫 在低溫下，細(xì)胞的代

27、謝活力及核分裂降低。 溫度不低于0 時(shí)，雖影響細(xì)胞代謝，但并無傷害作用；再把細(xì)胞置于2535 時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度減慢。 若溫度過低，在降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。 若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲基亞砜等，封入凍存管，置于液氮中，細(xì)胞可耐受70 以下溫度，能長期儲(chǔ)存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長增殖，生物性狀不受影響。低 溫 在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低。高 溫 細(xì)胞在40數(shù)小時(shí)后，再置回37 培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長；但如果在40 下暴露時(shí)間太長，對(duì)細(xì)胞生長不利，甚至變圓脫離瓶底。 細(xì)胞在3940 培養(yǎng)1h，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升

28、高2 ，持續(xù)數(shù)小時(shí)，即在4142 中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，溫度至43 以上時(shí)細(xì)胞多數(shù)被殺死。 高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性。高 溫 細(xì)胞在40數(shù)小時(shí)后，再置回37 培養(yǎng)氣體環(huán)境和pH 氧（O2）參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。采用開放式培養(yǎng)時(shí)（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細(xì)胞置于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。氣體環(huán)境和pH 氧（O2）二氧化碳（CO2） CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。 大多數(shù)細(xì)胞適于在pH 7.27.4條件

29、下生長，低于pH 6.8或高于pH 7.6對(duì)細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。 細(xì)胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長有利。 隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放CO2增多，使pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：對(duì)細(xì)胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值。二氧化碳（CO2） CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生無污染及無毒直接或間接接觸的器皿、材料污染：細(xì)菌等微生物、細(xì)胞間、有害物質(zhì)無污染及無毒直接或間接接觸的器皿、材料本章小結(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞

30、的生長方式和類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素本章小結(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施 無菌實(shí)驗(yàn)室 超凈工作臺(tái) 恒溫培養(yǎng)箱 其他設(shè)備 （電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施 無菌實(shí)驗(yàn)室無菌實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。組成： 更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。 緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與 幾個(gè)操作間相通。 操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)， 房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。無菌實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)超凈工作臺(tái) 分類側(cè)流式：氣流由左側(cè)或右側(cè)通過臺(tái)面流向?qū)?cè)直流式：氣流從上向下