BDFACSCalibur流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護(hù)程序目的：規(guī)范BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護(hù)程序，正確使用設(shè)備，保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行、操作人員人 身安全和設(shè)備安全。適用范圍：本規(guī)程適用于BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀的使用操作。責(zé)任者：操作人員：負(fù)責(zé)按照本規(guī)程操作儀器設(shè)備，對(duì)儀器進(jìn)行日常維護(hù)，并作使用記錄。保管人員：負(fù)責(zé)監(jiān)管儀器操作是否符合規(guī)程，并對(duì)儀器進(jìn)行定期維護(hù)、保養(yǎng)。科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)儀器設(shè)備的綜合管理。內(nèi)容：每日開機(jī)程序在氣壓閥減壓的狀態(tài)下檢查鞘液桶，確認(rèn)：鞘液充滿狀態(tài)，約3L蓋緊蓋子安上金屬擋板管路暢通，無(wú)扭曲.檢查廢液桶，確認(rèn)：廢液桶充滿400ml漂白劑管路暢通

2、，無(wú)扭曲打開流式細(xì)胞儀。打開電腦。氣壓閥置于加壓位置，并排除管路中氣泡。做 Prime。等待機(jī)器預(yù)熱510分鐘后可開始試驗(yàn)。每日關(guān)機(jī)程序用3mlFACSCIean洗液加入樣品管中上樣，將樣品支撐架置于旁位，以外套管吸入1ml。將樣品支撐架置于中位，以HI RUN運(yùn)行10分鐘，使內(nèi)管吸入約1ml。將樣品管換成蒸餾水重復(fù)1-2步。放置盛有1ml蒸餾水的試管于樣品支撐架上。選擇Standby模式10分鐘，將激光冷卻后可關(guān)掉主機(jī)。退出所有應(yīng)用軟件，關(guān)閉電腦。將流式細(xì)胞儀的壓力閥置于減壓狀態(tài)。每月維護(hù)程序?qū)ACSClean洗液12L裝入鞘液桶。旁路鞘液過濾器（過濾器上的快速接口從SANLINEFILT

3、ER端斷開，將鞘液白色管路液路取下聯(lián)到SANLINE FILTER 端口），以防傷害。將盛有3ml FACSClean洗液的試管置于樣品支架上，以HI RUN 30分鐘。將鞘液和樣品換成蒸餾水重復(fù)步驟3,以HI RUN 60分鐘。將鞘液桶裝滿鞘液，恢復(fù)過濾器。以 HI RUN 10-20 分鐘。在測(cè)定正式樣品之前實(shí)施每日開機(jī)程序。FACScomp自動(dòng)質(zhì)控操作試劑準(zhǔn)備三色試劑的校正（Cat No ： 340486）取四色試劑盒中的Unlabeled試劑，充分混勻，加一滴到裝有1ml鞘液的試管中，混勻，標(biāo)記為unlabeled 。取FITC、PE、PerCP、unlabeled試劑，充分混勻，各加

4、一滴到第二支裝有2ml的鞘液的試管中，混 勻，標(biāo)記為mixed 。上機(jī)進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)?；蛩纳噭┑男Ｕ–at No： 340486； Cat No:340487）取試劑盒中的unlabeled試劑和APC試劑各一滴加入到第一支裝有1ml鞘液的試管中，混勻。取5種試劑（FITC、PE PerCP、APC Un labeled）各一滴加入第二支裝有2ml鞘液的試管中，混勻。上級(jí)進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)。Calibrite beads FACScomp上機(jī)操作的具體步驟執(zhí)行FACSalibur開機(jī)程序；執(zhí)行 FACScom歌件；在運(yùn)行“ Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計(jì)算

5、機(jī)將保存這些信息；單 機(jī)“ Acceppt ”；進(jìn)入Set Up窗口，先看最左側(cè)的Assay selection選項(xiàng)，在里面選中Lyse/Wash或Lyse/NoWash；在Calibrite Beads Lot IDS中，根據(jù)每種顏色的beads所對(duì)應(yīng)的Lot ids，輸入編號(hào)，次編號(hào)在 Calibrite Beads試劑盒內(nèi)，打開新買的試劑盒，里面有一張橙色膠紙，取出貼在試劑盒的背 面，標(biāo)題是Calibrite BeadsT%Batch NO，選擇FACS Flow Sheath下的編號(hào)（右側(cè)的編號(hào)）；如做四色校正，同樣方法輸入 Calibrite Beads tm APC的IDS。在右側(cè)

6、的保存選項(xiàng)中文件會(huì)自動(dòng)保存，路徑FacstationBD fileFACSCompDDMMYY還可以單擊“ Location ”改變保存路徑；其他的不要改動(dòng)，直接單擊“ run”出現(xiàn) PMT視窗，然后準(zhǔn)備好上樣管；上第一管后單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)PMT完成后儀器會(huì)在窗口底部出現(xiàn)一行提示：“ PMTs set Successfully ，這時(shí)軟件會(huì)暫停5秒，然后自動(dòng)進(jìn)入下一個(gè)調(diào)節(jié)窗口 （Comp窗口）；如果是四色微球調(diào)試，儀器還會(huì)對(duì)激光的延遲進(jìn)行測(cè)試，直到儀器電腦屏幕出現(xiàn)提示：“Time DelayCalibratio n was successful，然后才會(huì)同樣自動(dòng)進(jìn)入下一個(gè)調(diào)節(jié)窗

7、口（Comp窗口）；上第二管，單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)補(bǔ)償并進(jìn)行靈敏度測(cè)試。完成后儀器會(huì)給出提示，最后軟件給出一個(gè)Summary Report。檢查報(bào)告中的“ Result ”是否都PASS如果有沒有PASS堅(jiān) 持原因。（1）是否試劑過期（2）兩個(gè)試管中的液體和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常維護(hù)是否充分適當(dāng)（5）聯(lián)系BD人員打印報(bào)告，退出FACScom軟件；計(jì)算機(jī)會(huì)自動(dòng)把FACScom測(cè)試結(jié)果保存在Calib File或Calib File .LNW （免洗試驗(yàn)）中，運(yùn)行其他程 序，調(diào)用這些結(jié)果就可以進(jìn)行樣本的檢測(cè)。注意事項(xiàng)：1、第一管的速率不能低于400個(gè)/秒（run

8、 high），少于時(shí)可以補(bǔ)一滴Unlabeled。2、兩個(gè)試管中的鞘液必須和鞘液桶中的是同一種液體。FACScomp校正HLA-B27的操作說明試劑的準(zhǔn)備：取HLA-B27試劑盒的HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）試劑，混勻，加兩滴到裝有1ml鞘液 的試管中，混勻，待測(cè)。FACScomp上機(jī)檢測(cè)HLA-B27的具體步驟執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序；運(yùn)行 FACScomp 軟件；在出現(xiàn)“ Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計(jì)算機(jī)將保存這些信息；單 機(jī)“ Accept ”；進(jìn)入“ Set up ”窗口，先看最

9、左側(cè)的 Assay selection 選項(xiàng)，選擇 HLA-B27 Assay，在進(jìn)行 HLA-B27 Assay之前，必須一次性的通過Lyse/Wash Assay校正；在右側(cè)框中輸入正確的HLA-B27 Lot No值、Suffix值和Beads Lot No值。這些參數(shù)分別決定了 FL1 PMT的標(biāo)準(zhǔn)和decision maker的位置。對(duì)于結(jié)果至關(guān)重要，不可弄錯(cuò)；在右側(cè)的保存選項(xiàng)中文件會(huì)自動(dòng)保存，路徑日期，還可以單擊“ Location ”改變文件保存路徑；其他的不需要改動(dòng)，直接單擊“run ”出現(xiàn)PMT視窗，然后準(zhǔn)備好上樣；放上Beads管后單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)PMT完成

10、后儀器會(huì)在底部出現(xiàn)一行提示：“PMTs set successfully ”這時(shí)軟件會(huì)暫停5秒，調(diào)試后的結(jié)果會(huì)自動(dòng)保存在Calib File.B27中，并生成summary Report；退出FACScomp軟件，然后進(jìn)入HLA-B27軟件進(jìn)行檢測(cè)。MultiSET四色免洗淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：用已知總數(shù)的熒光微球Beads做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，加入血中，再加入熒光抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞儀中的獲取和分析軟件，就可以得出血中CD3 CD4 CD8 B、NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。細(xì)胞（/ ul）=（細(xì)胞獲取數(shù)x Beads總量）/（ Beads獲取數(shù)樣本量）主要試劑：抗體：CD3/CD8/CD45/CD4 C

11、D3/CD16+56/CD45/CD19 四色熒光抗體。Trucount管（內(nèi)含數(shù)量已知的Beads）。FACS Lysing Solution （溶血素）（1 0 x，使用前用蒸餾水稀釋成1x）實(shí)驗(yàn)步驟 :取2支TruCount管，順序編號(hào)A和B;用反向加樣法在Tube中加入50ul充分混勻的抗凝全血；注意：血不要碰到試管底部的微球 （Beads）。取 20ulCD3/CD8/CD45/CD4 抗體加入到 A 管中；取 20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19 抗體加入到 B 管中。注 意：不要碰到血。渦旋混勻，室溫避光放置15-20min ；634加入450譏1 X FACS溶血

12、素，充分混勻，室溫避光放置15min ;24小時(shí)內(nèi)上機(jī)，用MultiSET軟件獲取15000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，上機(jī)前應(yīng)充分混勻。注意事項(xiàng)：樣本使用EDTA抗凝全血，室溫放置，24小時(shí)內(nèi)處理，處理前充分混勻。取血時(shí)要采用反向加樣法，即加樣槍吸取血樣時(shí)，打到第二擋，放時(shí)打到第一檔，保證血量的準(zhǔn)確，減少 誤差。染色和溶血步驟應(yīng)在室溫避光進(jìn)行，并充分混勻，過程中盡量防止血樣的飛濺，以免血樣留在管壁上。本實(shí)驗(yàn)為免洗試劑，操作簡(jiǎn)單，減少細(xì)胞的丟失提高工作效率和計(jì)數(shù)精確度。TruCOUNT管2-25C保存，從冰箱取出后，應(yīng)恢復(fù)室溫再打開封條，保證TruCOUNTf包裝袋密閉，袋內(nèi)干燥劑變成粉紅色時(shí)，TruCO

13、U NT管應(yīng)棄去不要MultiSET軟件收獲分析的具體操作執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序，進(jìn)入MuliTSET軟件。在出現(xiàn)“sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、負(fù)責(zé)人姓名等信息，計(jì)算機(jī)將保存這些信息；相關(guān)信息，單機(jī) Accept ”。進(jìn)入“ set up ”窗口：在“ Data Source ”對(duì)話框中選擇“ From Cytometer : Acquisition and Analysis ”；在“ Automatic Saving Options ”中選者 Data File ”,laboratory Report 、“PhysicianReport ”，軟甲會(huì)自動(dòng)生成并保存

14、報(bào)告文件，文件的默認(rèn)路徑FaacstationBD fileMultisetDDYYMM文件夾； 7.4 在“ View Report ”中選擇“ Until Next Button Pressed ” .然后單擊“ Accept ”，進(jìn)入“ FACSComp窗口，單擊“ skip FACSComp （四色儀器調(diào)整FACSComp在檢測(cè)前單 獨(dú)完成，見FACSCom操作部分）。進(jìn)入“ Test Prefs ”窗口，在“ Physicians Report Choices ” 一項(xiàng)可以全選，運(yùn)行一種試劑，會(huì)自動(dòng)報(bào) 告相應(yīng)的結(jié)果。在“ Lot ID ”中輸入TruCount管批號(hào)和Beads總數(shù)（

15、標(biāo)在包裝袋上），單擊“ Accept ”。進(jìn)入“ Samples”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的Patient Name、IDCase Number和在Panel中選擇 4color TBNK+Truc ；在窗口最上方“ Cytometer ”的下拉菜單中依次選擇“ Detectors/Amps 、“ Threshold ”, “Compensation ”“Staus ，出現(xiàn)相應(yīng)的四個(gè)窗口；在“Cytometer的下拉菜單中，單擊“InstrumentSetting ”，在出現(xiàn)的新對(duì)話框中單擊“open ”；打開路徑下 FacstationBD fileInstrumentSettingCalib

16、ur.LNW文件，調(diào)用儀器各個(gè)參數(shù)條件，最后單擊“Open”“Set”“Done”。單擊“ Run Test ，上樣，此時(shí)調(diào)整SSC電壓和閾值，單擊“ Acquire ”。獲取完成后，可以打開屏幕底部的“Manual Gate”人工調(diào)整各個(gè)門的大小，單擊“Continue ”，進(jìn)入醫(yī)生報(bào)告窗口“ Phys Report ”，可打印。繼續(xù)其他實(shí)驗(yàn)，或單擊“ Quit ” , “Don,t Save ” ,退出MultiTest軟件。操作中特別注意第3-7步， 尤其是第7步。注意：做相對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)，用普通的流式管代替TruCount管，在Panel中選擇4colorTBNK。做三色絕對(duì)或相對(duì)計(jì) 數(shù)時(shí)，

17、只需改變Panel即可。CellQuest Pro雙色淋巴細(xì)胞亞群分析樣本制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康?使用雙色組合標(biāo)記抗體對(duì)人外周血中淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，了解認(rèn)得免疫狀態(tài)。從而指導(dǎo)臨床 診斷和治療。實(shí)驗(yàn)原理:利用熒光技術(shù)，在不同的鼠抗人的抗體上標(biāo)記熒光素，此熒光抗體就同人淋巴細(xì)胞表面是CD分子 特異性的結(jié)合；然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)合分析軟件的自動(dòng)分析，便可以得出各亞 群細(xì)胞的百分比。主要試劑：流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）,臺(tái)式離心機(jī)，渦旋振蕩器，微量移液器（1000 P L, 200 P L, 20P L,流失細(xì)胞專業(yè)試管、鞘液；PBS (加0.1%疊氮鈉)；832 雙色檢測(cè)試劑： Isotyp

18、e Control ( MouselgG/IgG 2a)(CD3-FITC/CD19-PE CD3-FITC/CD4-PE CD3FITC/CD8-PE CD3-FITC/CD16+CD56-PEFACS Lysi ng Solution紅細(xì)胞裂解液(10 x，使用前用蒸餾水稀釋成1 x)o1%的多聚甲醛，配制方法：稱1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56C水浴箱中使之溶解，用1N NaOH溶液和1N的HCL調(diào)整PH值在6.9-7.0,然后加入100ml容量瓶中定容，最后用0.45 P m的濾膜過濾。實(shí)驗(yàn)步驟：取5支流式試管，編號(hào)為1、2、3、4、5,分別取10 P L抗凝全血加入每支試管中，注

19、意不 要碰到管壁。輕輕混勻，依次加入 20 P L 雙標(biāo) Isotype Control ( MouselgG/IgG 2J、CD3/CD19 CD3/CD4 aCD3/CD8 CD3/CD16+CD5熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。取出試管，每管加入10倍稀釋的1 x FACS Lysing Solution 2ml，渦旋混勻，避光10分鐘。300g離心5min,棄去上清液。每管加入2ml的PBS渦旋混勻，300g離心5min,棄去上清液。然后加入0.5mlPBS混勻，4 C避光1h內(nèi)上機(jī)檢 測(cè)；若不能及時(shí)上機(jī)，加入0.5ml 1%多聚甲醛，放4c冰箱保存，48h內(nèi)上檢測(cè)。CELLQuest

20、 Pro的簡(jiǎn)要操作步驟(1)Acquisition獲取數(shù)據(jù)打開獲取模板(ACQ文件)，如無(wú)現(xiàn)成的模板則制作新模板：選擇點(diǎn)圖或直方圖工具,在窗口拖出大小合適的方框,點(diǎn)擊圖形的邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Plot Type 點(diǎn)圖類型：如 Acquisition 獲取X Parameter 橫軸參數(shù)：如 FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù)：如 SSCGate 設(shè)門：如 No Gate 或 G1=R1圖形設(shè)置完畢，選擇SAVE AS/保存為 ACQ文件聯(lián)機(jī) Acquire Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisitio

21、n control 禾口 Browser 窗口，先將 Browser 窗口最小化；數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：Acquire Acquisition & Storage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)(10000-ALL)-OK打開最小化的-Browser對(duì)話框選擇：Directory :單機(jī)Change設(shè)定存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件的文件夾；File設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴(Prefix )-自定義；文件后綴(Suefix )-管號(hào)(設(shè)為1),單機(jī)ok；檢測(cè)或設(shè)置panel ,確定試驗(yàn)組合；如果沒有相應(yīng)的panel則設(shè)置新的panel ： Acquire Edit panel ,在彈出的對(duì)話框單擊add選 項(xiàng)，在new pan

22、el中輸入新的panel名稱,然后單擊前面的三角選中該panel激活Tubes窗口，單擊add加試驗(yàn)管，編輯各 試驗(yàn)管的P1, P2, P3, P4確定實(shí)驗(yàn)組合，單擊ok；然后按照已有panel操作；已有 panel 的在 Un titled Acquire Tube List下來(lái)菜單中選擇 Load Tubes From Pan el 4選擇新編輯或?qū)嶒?yàn)對(duì)應(yīng)的 panelAcquire Counter 打開計(jì)算器。打開獲取條件窗口，調(diào)出實(shí)驗(yàn)獲取條件(Instrument Setting )Cytometer-Detectors/Voltage , Threshold , Compensati

23、onCytometer-Instrument Setting-Open 打開實(shí)驗(yàn)獲取條件(FACSStation-BD File- Instrument SettingFiles-Calib file 或者 Calib file.LNW) Open-set-done943實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整：Acquisition Control-VSetup-上樣(第一管)-Acquire-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整：FSC SSC電壓。FSC閾值(Threshold)：減少碎片。設(shè)門：FSC/SSC點(diǎn)圖設(shè)門（R1）；熒光（FL）點(diǎn)圖（如FL1/FL2 ）或直方圖（如FL1）取門G仁R1 （點(diǎn) 擊圖形 的邊緣-I

24、nspector-Gate ： G1=R1）。陰性對(duì)照管，調(diào)整熒光電壓（FL1、FL2、FL3、FL4Voltage），使陰性群體在左下角，確定十字位 置。換地2管，多色實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)償管（單陽(yáng)性），調(diào)整熒光間補(bǔ)償（Compensation）：（1 ） Cytometer-Instrument Setting-Save 保存實(shí)驗(yàn)獲取條件（InstrSet+ 實(shí)驗(yàn)獲取名稱）-Done （此步驟為可選項(xiàng)）；尸n0-5丫0保存模板ACQ文件（新作模板）。（2） Acquisition-Counter，打開計(jì)數(shù)器。9.5順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- Setup-上樣-Ac

25、quire-儀器獲取足夠細(xì)胞后， 自動(dòng)保存數(shù)據(jù)文件（data file），Quit- Don,t saveCELLQuest Pro的簡(jiǎn)要操作步驟（2）A nalysis數(shù)據(jù)分析（新作模板人附文件）做FSC/SSC點(diǎn)圖，圈細(xì)胞R1選擇點(diǎn)圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇第一管數(shù)據(jù)文 件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù) -SSC; Gate 設(shè)門 -No Gate 10.1.1.3選擇設(shè)門工具-在FSC-SS

26、C點(diǎn)圖上，圈細(xì)胞R1做陰性對(duì)照管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2點(diǎn)圖，設(shè)十字，區(qū)分陰性和陽(yáng)性界限選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形邊緣Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇陰性對(duì)照管數(shù)據(jù) 文件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù) -FL2; Gate 設(shè)門 -G1=R1 10.1.2.3選擇十字工具-在陰性對(duì)照管FL1/FL2點(diǎn)圖上，沿陰性群體設(shè)十字 10.1.3做各實(shí)驗(yàn)管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2點(diǎn)圖，拷貝陰性對(duì)照管的十字.1選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方

27、框，點(diǎn)擊圖形邊緣.2 Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Analysis 分析；Select File 選擇實(shí)驗(yàn)管數(shù)據(jù)文 件；X Parameter 橫軸參數(shù) -FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù) -FL2 ； Gate 設(shè)門 -G1=R1 10.1.3.3店中陰性對(duì)照管FL1/FL2點(diǎn)圖上的十字二Edit-Copy-點(diǎn)中試驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖-Edit-Paste 10.1.4做各實(shí)驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖的十字統(tǒng)計(jì)：點(diǎn)中試實(shí)驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖-Stat-Quadrant Stat- 出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果-點(diǎn)中統(tǒng)計(jì)結(jié)果框-Stat-Edit Q

28、uadrant Stat-選擇輸出結(jié)果（如Percent of gated門內(nèi)細(xì)胞陽(yáng)性百 分率）。選擇文字工具（A）,在報(bào)告上添加文字說明，報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Save As保存分析模板（ANA文件）或分析結(jié)果，Print打印分析結(jié)果。An alysis數(shù)據(jù)分析（已有模板ANA文件）打開已保存的分析模板（ANA文件），依次改變各圖要分析的數(shù)據(jù)文件（Edit-Select All-Plots-Change Data File ），在出現(xiàn)的窗口中按文件存儲(chǔ)路徑找到數(shù)據(jù)，選中第一關(guān)文件-open ；在空白處單擊一下鼠標(biāo)，選中第 三個(gè)圖標(biāo)按蘋果+調(diào)出第二管文件；第四個(gè)圖蘋果+ 以此類推，調(diào)整圈細(xì)胞群的門R1

29、的位置，調(diào)整十字門位置，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果更改報(bào)告中結(jié)果，打印分 析結(jié)果。HLA-B27分析和軟件操作1.1 試劑：HLA-B27試劑盒-包括抗體試劑A,10 X溶血素試劑B,微球試劑C抗凝全血流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑和儀器。11.1.2制備流程：在試管上對(duì)應(yīng)于每一個(gè)樣本做好識(shí)別標(biāo)志（每個(gè)樣本一個(gè)試管）加30 L抗體到試管中11.1.2.3用微量移液器小心滴將50 11.1.2.3用微量移液器小心滴將50 PI充分混勻的康寧血加到進(jìn)樣管的底部，確保WBC勺濃度在3.533X 10 -9.4 X 10 WBC L之間，低速混勻3秒鐘，室溫避光靜置15-20分鐘；注意：小心避免血樣加到試管壁上，一面血與試劑

30、不能充分接觸，靜置時(shí)避免樣本直接光照。S10X溶血素用蒸餾水稀釋成1X,每管中加入2ml試問的1 X溶血素，立即低速混勻，避光試問靜置10分鐘，不要超過12分鐘；注意：溶血時(shí)間不應(yīng)太長(zhǎng)，以免破壞白細(xì)胞。隨后室溫300g離心5min棄去上清液，留大約50 PL液體于試管中以免損傷細(xì)胞團(tuán)低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入2ml含0.1%疊氮鈉的PBS清洗細(xì)胞，低速混勻，室溫300g 離心 5min吸去上清液，留大約50 PL液體于試管中以免損傷細(xì)胞團(tuán)低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入含1%-2%多聚甲醛的PBS來(lái)固定細(xì)胞，低速混勻，固定30分鐘將已處理好的樣本管蓋好，避光保存于2-8C以待上機(jī)檢測(cè)。最好在

31、染色后24小時(shí)以內(nèi)分析樣本，上樣前充分混勻懸液以防細(xì)胞聚集。HLA-B27自動(dòng)軟件上機(jī)檢測(cè)的具體步驟執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序，進(jìn)入HLA-B27軟件。在出現(xiàn)的“sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，單擊“ Accept ”，計(jì) 算機(jī)將保存這些信息。進(jìn)入$0士 up”窗口，首先在Data Source ”對(duì)話框中選擇“From Cytometer ，并輸入15000”。然后 在：“File name perfix ”中選擇“ Patientname ”；在“Automatic Saving Options”中選擇好Data File ”、“ Laborato

32、ry Report ”，軟件會(huì)自動(dòng)生成一個(gè)文件夾，文件的默認(rèn)路徑Facstation G5BD filesHLA-B27DDMMYY文件夾；C）單擊“ Location ”可改變文件保存路徑；在出現(xiàn)的新的對(duì)話框中指定的文件夾，選好文件夾后，單擊對(duì)話 框底部的“ chose ”（此步驟為可選項(xiàng)）。D）在“ View Report ” 中選擇“ Un til Next Button Pressed ；最后單擊“ Accept ”。進(jìn)入“ FACSCon”窗口，在這里可以進(jìn)入FACSCom軟件，做HLA-B27 beads的調(diào)試。如果之前做了就單擊“ Skip FACSComp”。進(jìn)入“ Patie

33、nts ”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的 Patient Name、ID、Case Number。然后單擊“ Rur”，單擊“ Acquire 。不要調(diào)節(jié)儀器的設(shè)置，儀器會(huì)自動(dòng)調(diào)出條件。獲取完成后打印Laboratory Report 。如果要繼續(xù)檢測(cè)單擊“ More Tests ”，如果退出單擊“ QUIT” - Don t save ”。退出軟件，按每日關(guān)機(jī)程序清洗儀器，關(guān)機(jī)?；蛴肅ellquest Pro/Cellquest手動(dòng)軟件進(jìn)行HLA-B27獲取和分析打開獲取模板（HLA-B27 ACQ文件）；或制作新模板：選擇點(diǎn)圖或直方圖工具，總共畫三個(gè)圖，兩個(gè)散點(diǎn)圖，一個(gè)直方圖。散點(diǎn)圖 FSC/S

34、SC 畫出一個(gè)新的散點(diǎn)圖后，在Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC; Y Parameter 縱軸參數(shù)：SSC; 選擇 Multicolor gate 屬性，Gate 設(shè)門：如 No Gate ；散點(diǎn)圖 FSC/CD3PE,畫出一個(gè)新的散點(diǎn)圖后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗 口選擇： Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC； Y Parameter 縱軸參數(shù)：CD3

35、PE;在圖中國(guó)門 R1 圈 上CD3+陽(yáng)性的細(xì)胞；直方圖 HLA-B27 FITC/Counts，畫出一個(gè)新的直方圖后，在 Windows-show Inspector， Inspector 窗 口選擇：Acquisition-Analysis 分析；X Parameter 橫軸參數(shù)：FITC,選擇門 G1=R1選擇Maker工具，在直方圖中畫 M1,圈定所有細(xì)胞，選中這個(gè)直方圖，對(duì)直方圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)-His-Stats，統(tǒng)計(jì)框中選擇 File Name、Maker label、%Gate Mean 和 Median；并且改 Plot 菜單 下的 Log dataUnit 屬性為 Chanel ,

36、 Acquire 菜單下 Acquisition & Storage 中的 Resolution 屬性為 256。設(shè)計(jì)試劑參數(shù)，在Acquire菜單中選擇Paarameter Description，在對(duì)話框中設(shè)定：P仁FSC P2=SSC, PS=HLA-B27 FITC, P4=CD3 PE。圖形設(shè)置完畢，選擇SAVE AS保存為HLA-B27 ACQ文件模板。聯(lián)機(jī) Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisition Control 窗口;數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：Acquire-Accquisition &Storage- 設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)(10000-ALL)

37、-OKWindows-Browser 對(duì)話框選擇：-Directory設(shè)定存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（ Prefix ）-自定義；文件后綴（Surfix ）-管號(hào);Cytometer-Detectors/VoltageCytometer-Instrument Setting-open 下找到并選擇Calibur file.B2711.3.5 樣本優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：AcquisitionCytometer-Detectors/VoltageCytometer-Instrument Setting-open 下找到并選擇Calibur file.B2711.3.5 樣

38、本優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：Acquisition(不能調(diào)節(jié)各熒光電壓和補(bǔ)償)：，在 Facstation G5BDfileInstrument 文件， Open-Set-Down.Control ? Setup-上樣-Acquire-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整調(diào)整FSC SSC電壓使細(xì)胞完全顯示在FSC/SSC圖上；調(diào)整FSC閾值（Threshold）：減少碎片；調(diào)整FSC/CD3 PE中的R1,圈定需要分析的細(xì)胞（CD3+ ;調(diào)整HLA-B27/Counts中的M1,圈定所有細(xì)胞。（M1可以畫的大一些）可以保存經(jīng)樣本優(yōu)化過的實(shí)驗(yàn)條件：Cytometer-Instrument Setting-Save保存實(shí)

39、驗(yàn)獲取條件（InstrSet B27 ） -Done。順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- DSetup-上樣-Acquire-儀器獲取足夠細(xì)胞后，自 動(dòng)保存數(shù)據(jù)文件（data file ）。調(diào)節(jié)FSC/CD3 PE中R1的位置準(zhǔn)確地圈定好需要分析的細(xì)胞；并同時(shí)調(diào)節(jié)HLA-B27/Counts中的M1,把所有細(xì)胞出現(xiàn)的峰全部圈??；His-Stats統(tǒng)計(jì)表中統(tǒng)計(jì)出B27的平均熒光，得出分析結(jié)果。輸入相關(guān)信息，保存并打印統(tǒng)計(jì)結(jié)果，退出程序。12. DNA測(cè)定材料和試劑抗凝外周血；DNA QC Particle , DNA測(cè)定質(zhì)量控制試劑盒（BD公司，349523） CE

40、N小雞紅細(xì)胞核，CTN小牛胸腺細(xì)胞核，2 Pm的熒光微球，核酸染料PI。CycleTEST PLUS DNA ReagentKit 試劑 A,試劑 B,試劑 C,緩沖液樣本制備質(zhì)控樣本的制備（DNA QC Particle ）CEN:輕輕搖勻后，吸取40 PL到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘，即可上機(jī)。CTN :大力震蕩試劑瓶，吸取40 PL到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘即可上機(jī)檢測(cè)。1222 外周血 DNA 羊本的制備（Cycle TEST PLUS DNA Reage nt Kit ）1222.1 將100 L抗凝外周血全加入17100-mm的管中加入1的溶血素2ml

41、,混勻，室溫放置10分鐘室溫300 g離心5分鐘，吸去上清液加入2mlPBS洗滌細(xì)胞1次，室溫3008離心5分鐘，吸取上清液加入250 PL A液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘加入250 PL B液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘加入250 PL C液，輕輕混勻，不要震蕩，低溫（28c ）避光靜置10分鐘用50 Pm尼龍網(wǎng)膜或35 P m細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞低溫避光放置以待上機(jī)檢測(cè)。建議在加入C液后3小時(shí)內(nèi)上機(jī)，上機(jī)前輕輕混勻細(xì)胞懸液。isition :用 CellQuest/CellQuest Pro 軟件獲取數(shù)據(jù)打開獲取模板（ACQ文件）或制作新模板：圖1 :選擇點(diǎn)圖，在窗口拖

42、出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點(diǎn)圖對(duì)話框或Inspector中，選擇：Acquisition 獲??；X Parameter橫軸參數(shù)：FSC Y Parameter縱軸參數(shù)：SSC OK-出現(xiàn)相應(yīng)的點(diǎn) 圖。圖2：選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點(diǎn)圖對(duì)話框或Inspector中，選擇：Acquisition 獲??；X Parameter 橫軸參數(shù)：FL2-W; Y Parameter 縱軸參數(shù)：FL2-A； OK-出現(xiàn)相應(yīng) 的點(diǎn)圖。圖3：選擇直方圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的直方圖對(duì)話框或Inspector中，選擇：Acquisition獲??；X Parameter橫軸參數(shù)：FL2

43、-A ； OK-出現(xiàn)相應(yīng)的直方圖。在本圖橫軸200和400的位置分別設(shè)M門，標(biāo)為M1和M2對(duì)此圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（Stats-Histogram Stats ），對(duì)M1和M2進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)：File name,Marker,%Gate,Mean,CV 。三個(gè)圖形都設(shè)置完畢，F(xiàn)ile中選擇SAVE AS保存模板ACQ文件。聯(lián)機(jī) Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn) Acquisition Control 窗口，出現(xiàn) Acquisition Control 和 Browser窗口，先將Browser窗口最小化；數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：Acquire-Accquisition &Storage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（20000） -OK； Acquire-Parameter Discription 對(duì)話框（Browser 窗口最大化）選擇：-Directory :單擊Change設(shè)定存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File ：設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix ）-自定義；文件后綴（Surfix ）-管號(hào)（設(shè)為1）,單擊 OK；打開獲取條件窗口，調(diào)出實(shí)驗(yàn)獲