蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法歸納

1、實(shí)驗(yàn)七 蛋白質(zhì)含量測(cè)定測(cè)定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲 (Biuret) 法，酚試劑法(Lowry) 法及紫外吸收法。 目的要求 1掌握測(cè)定蛋白質(zhì)的含量基本方法。了解染料法、雙縮脲法、 Lowry 法和紫外吸收法測(cè)定原理。一、染料法 實(shí)驗(yàn)原理 在酸性溶液中染料考馬斯亮藍(lán) G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合， 此時(shí)考馬斯亮藍(lán) G-250 顏色從紅 色變?yōu)樗{(lán)色，吸收高峰從 460nm 移至 595nm 。利用這個(gè)原理可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的 Lowry 法趨勢(shì)，因?yàn)樗僮骱?jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，染 料-蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強(qiáng)。本法的缺點(diǎn)是：對(duì)于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白氨基

2、酸組成有較大 差異的蛋白質(zhì)， 有一定誤差， 因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)與染料的結(jié)合是不同的， 故該法適合測(cè)定與 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。 器材 吸量管； 試管； 721 型分光光度計(jì)試劑標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：配成 0.1mg/ml 的溶液。待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。染料溶液：稱取考馬斯亮藍(lán) G-250 0.1g 溶于 95% 的酒精 50ml ，再加入 85% 的濃 磷酸 100ml ，用水稀釋至 1000ml, 混勻備用。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:試劑管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595

3、nm按上表分別向各支試管加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm 波長(zhǎng)處以0號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(A )。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取1ml樣品溶液(約含25250微克蛋白質(zhì))，加入染料溶液 5ml混勻，5min后 測(cè)定其595nm 吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。、雙縮脲(Biuret)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)原理在堿性溶液中，雙縮脲 (H 2N-CO-NH-CO-NH2)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(一CO-NH 2)，或與此相似的基團(tuán)如一CH2-NH 2, CS-NH 2， C(

4、NH)NH 2的任何化合物，無(wú)論這類(lèi)基團(tuán)直接相連 還是通過(guò)一個(gè)碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(CO-NH ),可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)， 且呈色強(qiáng)度在一定濃度圍與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正 比，可用比色法測(cè)定蛋白含量。測(cè)定圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速， 不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。 主要的缺 點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。試劑 雙縮脲試劑： 取CuS0 4 5H20（c.P.）1.5g和酒石酸鉀鈉（c.P.）6.0g以少量蒸餾水溶 解，再

5、加2.5mol / L NaOH 溶液300ml , KI 1.0g，然后加水至 1000ml。棕色瓶中避 光保存。長(zhǎng)期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白 （BSA ）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA濃度1g/L的A280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH 配制。器材1 .試管：15 X150mm試管7只；1ml , 5ml 移液管；.

6、坐標(biāo)紙;. 721分光光度計(jì)。操作步驟取試管7支，編號(hào)，按下表操作:試劑管號(hào)空白12345測(cè)定管管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L ）- 0.10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測(cè)樣品-0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L ）01020304050混勻，37 C水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)540nm 處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。15為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測(cè)得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì) 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測(cè)定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項(xiàng).雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu 2

7、+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子， 以防止CuSO 4 5H 20 不穩(wěn)定形成 Cu（OH） 2沉淀。酒石酸鉀鈉與 CuSO4 5H20之比不低于3 : 1，加入KI作為抗 氧化試劑。雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。黃疸血清、嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。思考題雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么？其它還有什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量？.請(qǐng)用雙縮脲法，設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的定量方法（除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外）。三、酚試劑法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法）實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色

8、化合物（雙縮脲反應(yīng)），同時(shí)使肽鏈展開(kāi)，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鎢酸、鉬酸同 時(shí)失去1個(gè)，2個(gè)或者3個(gè)氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)顏色大吸收峰波長(zhǎng)為745750nm,反應(yīng)式一）其藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定圍成正比，由此 可測(cè)出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時(shí)蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能使鉬離子在 pH10時(shí)螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸的顯色劑上，大大增加了 酚試劑對(duì)蛋白質(zhì)的敏感性。反應(yīng)式一3H 2OP2O5?13WO 3?5MoO 3?10H 2O3H 2OP2O5?14WO 3?4MoO 3?10H 2O（最反應(yīng)式3H 2OP2O5?13WO 2?5MoO 3?10H 2O3H 2OP2O5?14WO 2?4MoO 2?10H 2O烯醇化反應(yīng)烯醇化反應(yīng)