肺結(jié)核實驗室診斷課件

1、結(jié)核分枝桿菌的試驗室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗科 馬筱玲1結(jié)核分枝桿菌的試驗室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗科 馬筱玲1結(jié)核疫情及診斷進展 2結(jié)核疫情及診斷進展 2黛玉臉色蒼白， 瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)束了一場哀怨凄絕的愛情故事。 3黛玉臉色蒼白， 瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)我國結(jié)核病疫情 全球結(jié)核病第二高負擔國家，結(jié)核病疫情表現(xiàn)有“六多” 。一、感染人數(shù)多億人感染過結(jié)核菌，約占全國人口 的，高于全球平均水平。二、患病人數(shù)多活動性肺結(jié)核、傳染性肺結(jié)核患病率 分別為萬和萬，三、新發(fā)患者多全國每年新發(fā)活動性肺結(jié)核患者 萬， 其中傳染性 肺結(jié)核患者萬。 四、死亡人數(shù)多全國每年約有

2、萬人死于結(jié)核病。五、農(nóng)村患者多全國約有的結(jié)核病人集中在農(nóng)村， 主要在經(jīng)濟不發(fā)達的中西部地 區(qū)。六、耐藥患者多全國結(jié)核病耐藥率高達。 4我國結(jié)核病疫情 全球結(jié)核病第二高負擔國家，結(jié)核病疫情表現(xiàn)有“結(jié)核病實驗室診斷方法介紹5結(jié)核病實驗室診斷方法介紹5概 述結(jié)核病人的細菌學檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是結(jié)核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評價治療效果的可靠標準。由于結(jié)核菌的遺傳特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細菌學檢查方法存在著靈敏度低、操作復雜，需時間較長和影響因素較多，不易標準化等缺陷，使細菌學診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。6概 述結(jié)核病人的細菌學檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要

3、途徑和手段實驗室診斷方法病原學診斷輔助診斷 7實驗室診斷方法病原學診斷7病原學診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗三、熒光染色法四、培養(yǎng)法 五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗六、快速培養(yǎng)檢測法，七、色譜法 八、分子生物學法 九、噬菌體生物擴增法8病原學診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，8一、涂片抗酸染色鏡檢法： 國內(nèi)大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高陽性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存較久，可備復查；因費時、繁瑣，綜合醫(yī)療單位常因重視不夠，致涂陽檢出率低于，專業(yè)機構(gòu)涂陽率可達到。國外痰涂片陽性率可達，反復多次查，可增加到；9一、涂片抗酸染色鏡檢法： 國內(nèi)大多采用厚涂片，比薄涂片法可提涂片優(yōu)點

4、：簡便、快速、價廉 10涂片優(yōu)點：簡便、快速、價廉 10 涂片的缺點敏感性低：條菌特異性差：所有分枝桿菌均可著色無法區(qū)別死菌與活菌：結(jié)果均為陽性11 涂片的缺點敏感性低：條菌11痰菌假陰性原因病變是封閉或開放；病變性質(zhì)和其中能夠排出的菌量和排出時間間歇；結(jié)核分枝桿菌形態(tài)多樣性；12痰菌假陰性原因病變是封閉或開放；12二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗工作原理 將經(jīng)過消化滅活處理液處理的痰液、或其他體液標本混懸液置于具有符合光學要求基片的夾層杯中，經(jīng)過專業(yè)離心機離心將混懸液中細菌或細胞牢固附著基片上，并在夾層杯中直接染色后取出基片在載波片上封片，置顯微鏡下觀察。13二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗工作原理 將

5、經(jīng)過消化滅優(yōu)點：、操作方便，易于掌握。、片中結(jié)核菌分布均勻，染色效果清晰、液基結(jié)核菌制片技術較離心濃縮集菌法有顯著提高： 該方法將所有消化后標本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標本。 采用結(jié)核專用消化液，可有效殺滅結(jié)核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。 14優(yōu)點：14三、熒光染色法：是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結(jié)合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽性率可達，熒光法的缺點： 假陽性率較高， 保存時間短，不到個月15三、熒光染色法：是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，15四、

6、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第第天觀察，以后每周觀察一次菌落生長情況，第周若仍無生長，報告為陰性。優(yōu)點：準確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗.缺點：診斷周期長，最快也需要周。有一定的污染率16四、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基161717培養(yǎng)假陰性的原因個別細菌營養(yǎng)要求的特異性； 細菌和細菌營養(yǎng)代謝異質(zhì)性； 細菌培養(yǎng)前處理對細菌活性影響； 18培養(yǎng)假陰性的原因個別細菌營養(yǎng)要求的特異性； 18 分枝桿菌藥物敏感性試驗絕對濃度法檢測分枝桿菌藥敏實驗是采用含藥羅氏培養(yǎng)基進行的。常用藥物終濃度（） 表 絕對濃度法含藥培養(yǎng)基中的藥物終濃度 藥 物 濃

7、度（） 低濃度 高濃度 異煙肼 利福平 鏈霉素 乙胺丁醇 對氨基水楊酸 氨硫脲 乙硫異煙胺 卡那霉素 卷曲霉素 紫霉素 氧氟沙星 左氧氟沙星 環(huán)丙沙星 司帕沙星 力克肺疾 丁胺卡那 19 分枝桿菌藥物敏感性試驗絕對濃度法檢測分枝桿菌藥敏實驗是采用檢測方法 菌懸液的制備 .接種及培養(yǎng).結(jié)果判定與報告 敏感（一）： 含藥培養(yǎng)基上無菌落生長。 報告菌落數(shù)：當含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)在個以下時，報告菌落個數(shù)。耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥 ()： 含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長。20檢測方法 菌懸液的制備

8、20本法弊端 操作繁瑣需時久，周結(jié)果準確性差21本法弊端 操作繁瑣21五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗是年建立的一種痰標本液體培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡觀察技術。其原理是含有索狀因子，因此其在液體培養(yǎng)基中生長時分泌索狀因子，形成索狀特征性結(jié)構(gòu)，利用倒置顯微鏡觀察索狀結(jié)構(gòu)可用于的快速診斷。由于液體培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此生長迅速，使的培養(yǎng)時間顯著縮短，培養(yǎng)陽性率顯著增加。該法還能在培養(yǎng)的同時直接進行臨床標本的直接藥敏試驗，因此能顯著縮短從臨床標本到耐藥性測定的所需時間，這是其它傳統(tǒng)方法所不具有的，也是的最大優(yōu)點。22五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗是年建立的一種痰標本液體液體培養(yǎng) 顯微鏡觀察23液體培養(yǎng) 顯微鏡觀察

9、23結(jié) 論本試劑檢測簡便，快速，天就可獲得多耐藥結(jié)核桿菌的檢測結(jié)果，同時具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結(jié)核病的快速檢測。痰標本直接藥敏試驗比常規(guī)方法提早周，更具有快速診斷價值。本試劑費用低廉，不需特殊儀器設備，適合基層推廣應用。本法安全、對預防耐藥結(jié)核病的流行與傳播、防止實驗室工作人員的感染具有重要意義。24結(jié) 論24六、快速培養(yǎng)檢測法. 培養(yǎng)系統(tǒng). 培養(yǎng)系統(tǒng)25六、快速培養(yǎng)檢測法. 培養(yǎng)系統(tǒng)25. 培養(yǎng)系統(tǒng) 基本原理 培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測儀測試熒光強度，并判定

10、結(jié)果。優(yōu)點：快速 天培養(yǎng)陽性 簡便 比常規(guī)法操作簡便， 培養(yǎng)陽性率高于法 缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于法，產(chǎn)品依賴進口，價格較貴26. 培養(yǎng)系統(tǒng)26 培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測技術檢測培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應器，當培養(yǎng)瓶中有細菌生長，產(chǎn)生、下降時，顏色感應器由綠色變成黃色。儀器自動連續(xù)檢測，檢測的數(shù)據(jù)輸入計算機，根據(jù)計算結(jié)果自動顯示培養(yǎng)瓶中有無分支桿菌生長。優(yōu)點：快速 天培養(yǎng)陽性 簡便 比常規(guī)法操作簡便， 培養(yǎng)陽性率高于法 缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于法， 產(chǎn)品依賴進口，價格較貴。27 培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測技術檢測培養(yǎng)系統(tǒng)中分

11、支七、色譜法 分為氣相色譜()、氣液相色譜、高效液相色譜()等等能檢測分枝桿菌代謝過程中的揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸所產(chǎn)生的含量，出現(xiàn)不同的色譜峰，從而可鑒定結(jié)核桿菌和大部分菌種，且可測藥敏。優(yōu)點：簡單、快速、定量、重復性好，與質(zhì)譜()聯(lián)用更好；缺點：儀器昂貴，維護不易，無法普及。 28七、色譜法 分為氣相色譜()、氣液相色譜、高效液相色譜()等八、分子生物學法 利用分子生物學檢測方法來檢測結(jié)核桿菌特異性基因片斷，從而為結(jié)核病的快速診斷提供依據(jù)。、聚合酶鏈反應()：、核酸探針()、染色體核酸指紋法：、()序列法、耐藥基因的檢則：、其它分子生物學方法29八、分子生物學法 利用分子生物學檢測方法來檢、聚合

12、酶鏈反應()：能快速擴增結(jié)核分枝桿菌，檢測假陽性和假陰性問題是影響其應用的關鍵問題。對于存在的問題對策如下：擴增產(chǎn)物特異性鑒定探針雜交高質(zhì)量試劑（建立國家級檢定考評）規(guī)范化操作（培訓操作人員）質(zhì)量控制 （標準實驗室）30、聚合酶鏈反應()：能快速擴增結(jié)核分枝桿菌，30、核酸探針()探針是一小段帶標記而能識別特異性核苷酸序列的單鏈分子。、染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內(nèi)切酶圖譜()和限制性酶切片段長度多態(tài)性()分析等，用于菌株菌種鑒定和流行病學調(diào)查研究。31、核酸探針()探針是一小段帶標記而能識別特異性核苷酸序列的單、()序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來。

13、、耐藥基因的檢則：已查出的結(jié)核桿菌耐藥基因有(對利福平)，、(對異煙肼)，(對乙胺丁醇)，、(對鏈霉素)，(對吡嗪酰胺)和(對氟喹諾酮類，則為低度耐藥)等。32、()序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌 九、噬菌體生物擴增法（） 該法建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定。近年來進展很快。33 九、噬菌體生物擴增法（） 該法建立，并用于結(jié)核33 檢測原理 分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)噬菌斑。 若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時間后在加噬菌體檢測，并以不

14、加藥管為對照，根據(jù)含藥管和不含藥管出現(xiàn)的噬菌斑情況即可判斷細菌的耐藥性。34 檢測原理 分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌噬菌體 病毒核酸衣殼只能在活的易感細胞內(nèi)生長溶原性感染和溶菌性感染35噬菌體 病毒核酸衣殼只能在活的易感細胞 特異性噬菌體識別,并與之結(jié)合36 特異性噬菌體識別,并與之結(jié)合36噬菌體進入細胞,并在其內(nèi)擴增;同時生產(chǎn)蛋白外殼,開始產(chǎn)生新的病毒顆粒37噬菌體進入細胞,并在其內(nèi)擴增;同時生產(chǎn)蛋白外殼,開始產(chǎn)生新的添加特異性殺病毒劑去除所有胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。38添加特異性殺病毒劑去除所有胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。終止殺病毒反應，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏

15、感細胞）39終止殺病毒反應，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏感細胞）39結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40細胞周圍的敏感細胞，并在其胞內(nèi)增殖41細胞周圍的敏感細胞，并在其胞內(nèi)增殖41經(jīng)過多個“感染增殖細胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見，清晰的噬菌斑42經(jīng)過多個“感染增殖細胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上4343結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染的噬菌體敏感細胞敏感細胞敏感細胞敏感細胞裂解, 釋放出來的噬菌體感染敏感細胞噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生噬菌斑 先以特異性噬菌體感染、裂解標本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染的噬菌體，而結(jié)核分枝

16、桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴增，進而裂解細胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細胞，在其胞內(nèi)擴增并裂解敏感細胞，敏感細胞菌苔上肉眼可見的噬菌斑。如待檢標本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細胞，敏感細胞菌苔上無噬菌斑出現(xiàn)。44結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染的噬菌體敏感細胞敏感細胞敏感細質(zhì)控 陽性對照 個噬菌斑 陰性對照 個噬菌斑結(jié)果判斷標準標本 陽性結(jié)果 個噬菌斑 陰性結(jié)果 個噬菌斑陰性：無噬菌斑陽性：可數(shù)噬菌斑陽性：噬菌斑部分融合陽性：噬菌斑完全融合45質(zhì)控結(jié)果判斷標準標本陰性：陽性：陽性：陽性：45適用范圍可檢測痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標

17、本用于結(jié)核病的實驗診斷抗癆治療效果的評價尤其是初診病人的鑒別診斷用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測用于高危人群的鑒別診斷 From England !46適用范圍可檢測痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標本F藥敏試驗47藥敏試驗47 M. tb bacillus Sensor cellSensor cellSensor cellSensor cellSensor cell指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞l 室溫分鐘 小時小時加入殺毒劑加入培養(yǎng)基和指示細胞藥物細菌小時加入噬菌體48 敏感株結(jié)果 無 含49 敏感株結(jié)果 無 耐藥株結(jié)果 無 含 50耐藥株結(jié)果 無 含 50上 海 市 結(jié) 核

18、（肺） 重 點 實 驗 室 方法評價優(yōu)點快速：小時比較靈敏：條檢測活菌：相對定量：安全：51上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 室 方法評價缺點操作步驟多影響因素多有假陽性和假陰性 假陰性率假陽性率52上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 室假陽性和假陰性原因噬菌體的交叉感染 種檢測結(jié)果陽性 （偶然、胞內(nèi)、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對結(jié)果的影響 53上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 輔助診斷一、免疫學診斷方法二、血清學診斷三、酶學診斷54輔助診斷一、免疫學診斷方法54一、免疫學診斷方法皮試，用于鑒別診斷有參考意義。細胞亞群和一些細胞因子：、()、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標前后對比。55一、免疫學診斷方法皮試，用于鑒別診斷有參考意義。55二.血清學診