免疫分析法專題知識培訓(xùn)課件

1、免疫分析法專題知識免疫分析法專題知識一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容2免疫分析法專題知識一、概述主要內(nèi)容2免疫分析法專題知識一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容3免疫分析法專題知識一、概述主要內(nèi)容3免疫分析法專題知識 免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對機體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理損傷的機制，研究有效的免疫措施，實現(xiàn)以防病，治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。一、概述4免疫分析法專題知識 免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反 什么叫免疫分析？基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進行檢測的一種技術(shù)手段?？乖贵w反

2、應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于抗原或抗體的檢測，用于免疫學(xué)診斷。5免疫分析法專題知識 什么叫免疫分析？5免疫分析法專題知識(1) 在實驗藥物動力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測定生物利用度和藥物代謝動力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2) 在藥物的臨床檢測中，對治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血液濃度進行監(jiān)測；(3) 在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液中快速測定有效組分的含

3、量，以實現(xiàn)對生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測；(4) 對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進行評價。在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：6免疫分析法專題知識(1) 在實驗藥物動力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測定生物利用度和藥物免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來選擇性識別和測定，可以作為抗體或抗原的待測物.免疫分析方法非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標(biāo)記免疫分析標(biāo)記物有無非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析電化學(xué)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫分析7免疫分析法專題知識免疫分析：非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標(biāo)記免疫分析檢測的發(fā)展放射免疫檢測（

4、興起于20世紀70年代)酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀80年代，各臨床機構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)（20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。8免疫分析法專題知識免疫分析檢測的發(fā)展放射免疫檢測（興起于20世紀70年代)酶聯(lián) 特點可逆性比例性反應(yīng)階段性特異性免疫分析法的特點9免疫分析法專題知識 特點可逆性比例性特異性免疫分析法的特點9免疫分析法專題知識特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性10免疫分析法專題知識特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性10免疫分析法專題知可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體

5、結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。影響因素： 抗體對相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復(fù)合物的影響pH、離子強度 11免疫分析法專題知識可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可比例性和反應(yīng)階段性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適 12免疫分析法專題知識比例性和比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系1一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)

6、四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容13免疫分析法專題知識一、概述主要內(nèi)容13免疫分析法專題知識2.1 定義抗原（antigen）：指在機體中引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)。免疫原性（immunogenicity）：被注射入動物體內(nèi)后，使其產(chǎn)生循環(huán)抗體或改變免疫細胞的反應(yīng)性抗原特異性（antigenic specificity）：具有能與特異抗體作用的性質(zhì)全抗原（complete antigen）半抗原（hapten）：只能與特異抗體作用，但不引起機體免疫應(yīng)答的分子14免疫分析法專題知識2.1 定義抗原（antigen）：指在機體中引起特異性免疫2.2 藥物分子的抗原性1、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的

7、藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物也是完全抗原。2、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會發(fā)生改變。15免疫分析法專題知識2.2 藥物分子的抗原性1、藥物分子的免疫原性15免疫分析法3、藥物分析中，為了得到高效價的抗血清，通常會與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進行試驗。常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。16免疫分析法專題知識3、藥物分析中，為了得到高效價的抗血清，通常會與蛋白質(zhì)載體合（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離

8、羧基縮合形成肽鍵甾體：通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接17免疫分析法專題知識（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽（2）半抗原和載體的選擇原則半抗原：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)的微環(huán)境；合理利用分子類似物之間的交叉反應(yīng)。載體：載體對監(jiān)測系統(tǒng)的影響；載體效應(yīng)在免疫過程中的影響。18免疫分析法專題知識（2）半抗原和載體的選擇原則半抗原：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應(yīng)考（3）合成抗原的測定定性測定方法：光譜分析、熱力學(xué)分析定量測定方法

9、：相對含量測定；絕對含量測定。19免疫分析法專題知識（3）合成抗原的測定定性測定方法：光譜分析、熱力學(xué)分析19免一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容20免疫分析法專題知識一、概述主要內(nèi)容20免疫分析法專題知識免疫分析實際上是一種特殊的試劑分析，特點是抗體成為分析試劑。 21免疫分析法專題知識21免疫分析法專題知識1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體泛指與待測分子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）, 受體（receptor）和其他結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 . 22免疫分析法專題知識1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體泛指與待測分子特

10、異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。 23免疫分析法專題知識免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個肽鏈組成的，抗體的基本結(jié)構(gòu)24免疫分析法專題知識抗體的基本結(jié)構(gòu)24免疫分析法專題知識IgG分子由四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連，有三個功能區(qū)?？贵w在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時通過hi區(qū)的轉(zhuǎn)動以適應(yīng)不同距離的抗原決定簇。與抗原結(jié)合后，IgG分子構(gòu)象改變，暴露出Fc上的活性位點，從而表現(xiàn)出固定和激活補體以及粘結(jié)單核細胞等親細胞反應(yīng)的功能。Fab：抗原結(jié)合片

11、段Fc：可結(jié)晶片段25免疫分析法專題知識IgG分子由四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連，有三個功能區(qū)。Fa胃蛋白酶木瓜蛋白酶巰基乙醇還原26免疫分析法專題知識胃蛋白酶木瓜蛋白酶巰基乙醇還原26免疫分析法專題知識胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（C端）裂解片段，F(xiàn)（ab）2，無Fc片段與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng) 27免疫分析法專題知識胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（N端）裂解片段，2個Fab（54KD），一個Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。 28免疫分析法專題知

12、識木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二2抗體作為分析試劑的評價抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需要簡單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性。這兩點奠定了分析免疫高度靈敏和高度專一的基礎(chǔ)。此外，抗體還有一個獨特的性質(zhì)：每個抗體分子有兩個抗原的結(jié)合點，即多價性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號反差。 29免疫分析法專題知識2抗體作為分析試劑的評價抗體的特異性是無與倫比的，不需或3、抗體的制備（1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制備、動物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。30免疫分析法專題知識3、抗體的制備（1

13、）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動免疫免疫原的制備免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達到油包水的程度。不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。31免疫分析法專題知識免疫原的制備免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑動物免疫通常的免疫動物為家兔和羊。免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點、靜脈。免疫抗原量通常為110mg或50100mg。32免疫分析法專題知識動物免疫通常的免疫動物為家兔和羊。32免疫分析法專題

14、知識試血及效價測定家兔的試血通常可由耳緣靜脈取血，取血量0.5ml。不同稀釋度的抗血清和1%的血細胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測血細胞的凝聚情況，即可測得免疫血清的效價。33免疫分析法專題知識試血及效價測定家兔的試血通?？捎啥夓o脈取血，取血量0.5m（2）單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細胞融合而獲得的雜交瘤細胞基礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個識別單一抗原表位的B細胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)法 & 接種動物體內(nèi)生產(chǎn)法34免疫分析法專題知識（2）單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細胞融合而獲得的雜交瘤細制備步驟35免疫分析法專題知識制備步驟

15、35免疫分析法專題知識2、抗體的純化利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專一性的抗體。36免疫分析法專題知識2、抗體的純化利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。363、特異性抗體的篩選與效價測定抗體的效價又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗體的效價指將血清稀釋，測定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價。常用的效價測定方法有免疫擴散法、間接血凝法和ELISA法等。37免疫分析法專題知識3、特異性抗體的篩選與效價測定抗體的效價又稱滴度，指某一物質(zhì)一、概述二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)

16、四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容38免疫分析法專題知識一、概述主要內(nèi)容38免疫分析法專題知識免疫分析法專題知識培訓(xùn)課件放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量范圍也明顯擴大。由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類競爭性體外放射分析

17、技術(shù).40免疫分析法專題知識放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）基本原理 基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競爭結(jié)合 ,這種競爭可用以下反應(yīng)式來表示： 抗原 抗體常用的標(biāo)記物：125 I和氚標(biāo)記物放射性活度（貝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰變比活度（Bp/g）：每單位質(zhì)量所含的放射性比活度游離狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)41免疫分析法專題知識基本原理 基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原具體步驟 抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的和游離的放射性物質(zhì)的分離放射性活度的測定柱色譜法吸附法沉淀法抗抗體發(fā)微孔濾膜法固相法求出結(jié)合率，繪制標(biāo)

18、準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）42免疫分析法專題知識具體步驟 抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的和游離的放射性活度的測定柱色譜法熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項技術(shù)以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原43免疫分析法專題知識熒光免疫分析法（Fluorescence immunoass熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合

19、物及其存在的部位在實際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)44免疫分析法專題知識熒光免疫分析法（Fluorescence immunoass根據(jù)實驗方法分類直接法間接法補體法其他45免疫分析法專題知識根據(jù)實驗方法分類直接法45免疫分析法專題知識直接法將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢操作簡便、特異性高、非特異性染色少敏感性低抗原標(biāo)記抗體熒光46免疫分析法專題知識直接法將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，間接法先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體（二抗

20、）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢未知抗原未標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體熒光47免疫分析法專題知識間接法先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的補體法利用補體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補體復(fù)合物發(fā)射熒光補體標(biāo)記抗補體抗體48免疫分析法專題知識補體法利用補體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補體復(fù)合物發(fā)射熒光補時間分辨熒光免疫測定 利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強度，從而推測待測物含量。49免疫分析法專題知識時間分辨熒光免疫測定 利用具有

21、雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）50免疫分析法專題知識基本原理酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）50免疫分析法專題知51免疫分析法專題知識51免疫分析法專題知識雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。 它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量