免疫組化實驗方法

1、關(guān)于免疫組化實驗方法第1頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四免疫組織化學(xué)的概念 利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。2第2頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四最突出的優(yōu)點在更廣闊的范圍內(nèi)，把結(jié)構(gòu)與功能及代謝結(jié)合起來，在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，達(dá)到方法統(tǒng)一，定性可靠，定位準(zhǔn)確，定量可能。3第3頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四免疫組化實驗標(biāo)本組織標(biāo)本（石蠟切片和冰凍

2、切片）細(xì)胞標(biāo)本（組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片）。石蠟切片對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔；4第4頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四細(xì)胞和組織的固定1固定的作用-使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固、終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，最大限度地保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖乐箍乖瓘浬ⅰ?選擇最佳固定液的標(biāo)準(zhǔn)：保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；保存抗原性。（1）醛類固定劑：穿透性較強(qiáng)，收縮性小，是常用的固定劑。如10中性福爾馬林液、4多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚

3、甲醛混合使用。（3）丙酸及醇類固定劑：沉淀蛋白質(zhì)和糖，保存抗原性較好。但對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用的固定方法-浸入法和灌注法（適用于動物實驗研究） 組織新鮮 勿干燥 體積適中 固定液足夠（20倍） 5第5頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四抗體常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。特性比較：均一性2. 穩(wěn)定性3. 特異性4. 重復(fù)性5. 沉淀反應(yīng)6第6頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四熒光素標(biāo)記抗體 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素。必備條件: 熒光顏色

4、與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。 結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響，用于活體內(nèi)標(biāo)記，結(jié)合物應(yīng)無毒，附加抗原性小。7第7頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四常用的染色方法根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法按標(biāo)記物定位于抗原所在部位的手段，則可將免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色方法分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法等。每進(jìn)行一步結(jié)合反應(yīng)。都會產(chǎn)生一次陽性結(jié)果的放大效應(yīng)。敏感性由高到低依次為橋連法、間接法、直接法。8第8頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四染色的基本程序標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合；用緩

5、沖液洗去未結(jié)合的成分；直接觀察結(jié)果；或顯色后再用顯微鏡觀察。9第9頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四反應(yīng)條件抗原抗體結(jié)合屬于可逆性反應(yīng)，具有共性的反應(yīng)條件：（1）PH：中性及弱鹼性條件（PH 78）有利于免疫復(fù)合物的形成（2）離子強(qiáng)度：0.010.02 M的低離于強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成（3）去污劑：有利于復(fù)合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.11%）（4）抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度：稀釋液中含無關(guān)蛋白質(zhì)可以減少抗體的非特異吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐劑：微生物生長會干擾抗原抗體反應(yīng)，稀釋液和抗體液中加入適

6、量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐（6）溫度和時間：較高的反應(yīng)溫度（37）可加速抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，低溫有利于抗原抗體結(jié)合率的提高（7）洗滌：除去未結(jié)合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色。選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10第10頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四熒光素 1，異硫氰酸熒光黃（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜為490495 nm，最大發(fā)射光譜為520530 nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。最常用。2四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine i

7、sothiocyante，TRITC）紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明。3四乙基羅丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐紅色粉未，最大吸收光譜570 nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈橙紅色熒光。價廉。11第11頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四染色注意事項（1）在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以免標(biāo)本上的試劑干燥。（2）酸堿度以接近體液環(huán)境為宜（PH 7.4左右）（3）組織細(xì)胞要求新鮮，最好使用冷凍切片，固定存檔標(biāo)本要求組織結(jié)構(gòu)完好。（4）切片經(jīng)染色后，應(yīng)及時觀察并照

8、相。切片在4冰箱內(nèi)過夜，其熒光強(qiáng)度將減弱約30。（5）調(diào)整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景非特異性染色最小為標(biāo)準(zhǔn)，對每一批抗體必須試驗摸索，找出最佳稀釋度。（6）所購抗體應(yīng)及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù)。12第12頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四酶標(biāo)抗體法通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞或組織表面或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察。常用的酶-辣根過氧化物酶（HRP），堿性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。優(yōu)點：與免疫熒光技術(shù)相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經(jīng)鋨酸處

9、理后，電子密度增強(qiáng)，可用于電鏡觀察。13第13頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四抗生物素-生物素-過氧化物酶技術(shù)(avidin-biotin peroxidase complex ABC)原理：利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第2抗體和生物素標(biāo)記的酶。其第1抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接。ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的。常用：ABC-HRP 辣根過氧化物酶：最通用的系統(tǒng)，使用范圍廣ABC-AP 堿性磷酸酶：靈敏度比較高，染色密度較低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶：靈敏度較

10、低，適用于組織內(nèi)源性HRP或者AP含量比較高的組織，常與HRP或者AP系統(tǒng)配合進(jìn)行雙染14第14頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四15第15頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四ABC法的特點：敏感性強(qiáng) 特異性強(qiáng)，背景染色淡方法簡便，節(jié)約時間可用于雙重或多重免疫染色。16第16頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四免疫金染色原理：免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗體，然后在光學(xué)顯微鏡下檢測抗原。解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的問題。整個檢測過程中無需酶的參與，因此不必預(yù)先處理樣本以消除內(nèi)源性酶的活性。17第17頁，共22頁，2022年，5月2

11、0日，9點49分，星期四免疫組化試劑的正確選擇和使用18第18頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四一抗1. 首選單克隆抗體：單克隆抗體具有高特異性、高親和力、交叉反應(yīng)少等特點，避免與細(xì)胞或組織蛋白的非特異性結(jié)合，減少染色背景。2. 多克隆抗體：最好是經(jīng)樣本來源種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉液（可以是BSA或二抗來源的正常動物血清）充分封閉，以阻斷非特異性結(jié)合位點。3. 跨膜分子的抗體選擇：要注意免疫原是整個蛋白分子或是胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。對于胞內(nèi)區(qū)抗體，染色時需要使用穿孔劑，而胞外區(qū)抗體不必使用。4. 正確使用：一般供應(yīng)商都會提供稀釋范圍和使

12、用方法。但常常需要重新選擇比例。一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作倍比稀釋。19第19頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四二抗種屬來源要匹配：根據(jù)所用一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應(yīng)選擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作5倍比稀釋。20第20頁，共22頁，2022年，5月20日，9點49分，星期四設(shè)立陽性對照和陰性對照-證明實驗系統(tǒng)的正確性1. 陽