免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用課件

1、免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用第一節(jié) 抗原或抗體的檢測(cè)抗原和相應(yīng)抗體，無(wú)論在體內(nèi)或體外相遇，均可發(fā)生各種各樣的反應(yīng)，統(tǒng)稱為抗原抗體反應(yīng)。 抗原-抗體反應(yīng)包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等。 抗原-抗體反應(yīng)可 用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原；也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性?？乖贵w反應(yīng)的規(guī)律和特點(diǎn) 抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。 1、 特異性 ：一種抗原只能和由它刺激產(chǎn)生的抗體相結(jié)合，不能跟與它無(wú)關(guān)的抗體發(fā)生反應(yīng)

2、。這種特性是由抗原的決定簇基于抗體可變的的化學(xué)組成、空間立體構(gòu)型所決定的。 2、 定比性 ：抗原一般都是多價(jià)的，而抗體（ IgG ）則是二價(jià)的，只有二者比例適合時(shí)，抗原抗體才能結(jié)合得最充分，形成的抗原抗體復(fù)合物最多，反應(yīng)最明顯，結(jié)果出現(xiàn)最快，此稱為等價(jià)帶 。3、可逆性：抗原與抗體的結(jié)合雖具有穩(wěn)定性，但由于二者之間是非共價(jià)鍵結(jié)合，因此又是可逆的，在一定條件下可解離，且解離后各自生物活性不變。 4、分階段反應(yīng) ：第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段，此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。 5 、敏感性 ：不僅可用于定性，還可用于

3、檢測(cè)極微量的抗原抗體，其靈敏程度大大超過(guò)當(dāng)前應(yīng)用的常規(guī)化學(xué)方法。抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響凝集反應(yīng)(Agglutination) 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集 現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。 1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)（Precipitation) 血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介

4、質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。單向免疫擴(kuò)散(Single Immunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)雙向免疫擴(kuò)散 （Double Immunodiffusion)位于凝膠不同小孔中的抗原和抗體，當(dāng)兩者相對(duì)擴(kuò)散時(shí)，經(jīng)一定時(shí)間后，若兩者相對(duì)應(yīng)，會(huì)在瓊脂小孔間、兩者最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬砂咨恋砭€。觀察沉淀線的位置、數(shù)量、形狀以及對(duì)比各沉淀線之間的關(guān)系，可對(duì)抗原或

5、抗體進(jìn)行定性分析。此方法可應(yīng)用于以下方面：（1）抗原或抗體的純度鑒定。也可對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）檢測(cè)未知抗原（或抗體）（3）抗原或抗體相對(duì)分子量的估計(jì)雙向瓊脂擴(kuò)散常見孔型有三孔型、雙孔型、雙排孔型、梅花孔型雙向免疫瓊脂擴(kuò)散孔型 三孔型雙孔型梅花孔型雙排孔型是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)?；鸺娪荆≧ocket Electrophoresis) 火箭電泳也稱免疫擴(kuò)散，是把單向免

6、疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動(dòng)，兩者比例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點(diǎn)是需時(shí)較短，故可用于快速沉淀標(biāo)本中抗原的含量?；鸺娪臼疽鈭D雙向免疫電泳（two dimentional immuno-electrophoresis）是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法。先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（Complement Fixation, CFT)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是一種有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅細(xì)胞和溶

7、血素（紅細(xì)胞的特異性抗體）是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。該方法敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢(shì)。免疫標(biāo)記技術(shù) 用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì) 標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。免疫熒光顯微技術(shù)(Immunofluorescence Technique) 是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素

8、，F(xiàn)ITC) 與抗體連接成熒光抗體，再與待測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。 包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。間接免疫熒光法示意圖酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。ELISA放射免疫測(cè)定法(Radioimmunoassay, RIA)是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的

9、高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。 Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線 7550 30 100110100 1000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）免疫印跡法(Immunoblotting)是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。該法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測(cè)多種病毒 如HIV 的抗體或抗原。免 疫 印 跡 法 示 意 圖免疫電鏡技術(shù)（immuno-electron microscopy, IEM）免疫電鏡技術(shù)是