定基因工程的概述

1、第一章 基因工程能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚(yú)普通熱帶斑馬魚(yú)是不發(fā)熒光的第一節(jié) 基因工程的概述 又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。指在體外通過(guò)人工“剪切”和“拼接”等方法，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。一、 什么是基因工程 獲得人類(lèi)所需的基因產(chǎn)物 結(jié) 果 剪切、拼接、導(dǎo)入、表達(dá)基本過(guò)程 DNA分子水平操作水平 基 因操作對(duì)象 生物體外操作環(huán)境基因拼接技術(shù)、DNA重組技術(shù)等 別 名二、轉(zhuǎn)基因操作的工具一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”主要來(lái)源：種類(lèi)與命名：作用特點(diǎn)：4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：識(shí)別特定核苷酸序列原核生物產(chǎn)生

2、黏性末端或平末端,切斷磷酸二酯鍵具有特異性。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成種類(lèi)與命名： 現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRSma粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）大腸桿菌（Escherichia coli R）Go back練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:Hind、Hind和Hind磷酸二酯鍵限制酶識(shí)別DNA特定的序列,使D

3、NA分子鏈的固定部位分開(kāi)。.Sma平末端平末端EcoR黏性末端黏性末端Go backEcoR黏性末端黏性末端Go back重復(fù)演示要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？ 會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?二、“分子縫合針” DNA連接酶作用: 把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).作用原理：催化磷酸二酯鍵形成 可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，Ecoli DNA

4、連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶類(lèi)型：類(lèi)型EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（二）“分子縫合針”DNA連接酶DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA聚合酶DNA連接酶化學(xué)本質(zhì)作用部位模板蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸二酯鍵（單個(gè)脫氧核苷酸+片段） 磷酸二酯鍵（DNA雙鏈片段 +DNA雙鏈片段）需要（DNA一條鏈）不需要“分子運(yùn)輸車(chē)”質(zhì)粒質(zhì)粒：裸露、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，具有自我復(fù)制

5、能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。3、運(yùn)載體（運(yùn)載工具）載基因進(jìn)入受體細(xì)胞常用的運(yùn)載體主要有兩類(lèi)： 1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒1、至少有一個(gè)（多個(gè)）限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入其中。2、重組運(yùn)載體進(jìn)入受體細(xì)胞后（或整合到染色體、DNA上），在受體細(xì)胞存在并進(jìn)行自我復(fù)制。3，有特殊的遺傳標(biāo)記基因，如抗四環(huán)素、氨芐青霉素等標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。（2）運(yùn)載體的特點(diǎn)DNA重組技術(shù)的三件工具：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、運(yùn)載體?？偨Y(jié)質(zhì)粒目的基因限制性內(nèi)切酶連接酶重組質(zhì)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因

6、的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成概念：基因文庫(kù) （gene library）基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)(gene library)（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).基因組文庫(kù)與部分基因

7、文庫(kù)的關(guān)系 如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫(kù)。這種方法稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄法cDNA文庫(kù)的構(gòu)建（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)原理：前提：原料方式PCR擴(kuò)增儀DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子 過(guò)程變性、退火、延伸三步曲變性：

8、加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸（3） 人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同種1.過(guò)程:二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心2、基因表達(dá)載體的作用a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？

9、為什么？3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。（一）轉(zhuǎn)化： 目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉

10、管通道法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉管通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因

11、），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 分子水平檢測(cè)是否插入目的基因是

12、否轉(zhuǎn)錄是否翻譯 個(gè)體生物學(xué)水平檢測(cè)鑒定1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程: 將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針； 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測(cè)知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開(kāi)，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mR

13、NA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:分 子 雜 交方法:抗原-抗體雜交過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。怎樣檢驗(yàn)抗蟲(chóng)基因在棉細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)呢？沒(méi)有抗蟲(chóng)基因的棉植株有抗蟲(chóng)基因的棉植株棉鈴蟲(chóng)蟲(chóng)沒(méi)有死蟲(chóng)被殺死沒(méi)有表達(dá)目的基因表達(dá)類(lèi)型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定 包

14、括抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達(dá)和檢測(cè)對(duì)位訓(xùn)練1.下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述,正確的是（ ） A.重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶 和載體 B.所有的限制酶都只能識(shí)別同一種特定的核苷酸 序列 C.選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)菌 繁殖快 D.只要目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞就能實(shí)現(xiàn)表達(dá)C2.利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，可生產(chǎn)人類(lèi)所 需要的產(chǎn)品。下列選項(xiàng)中能說(shuō)明目的基因完成了 在受體細(xì)胞中表達(dá)的是（ ） A棉花二倍體細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)菌的抗蟲(chóng)基因 B大腸桿菌中檢測(cè)到人胰島素基因及其mRNA C

15、山羊乳腺細(xì)胞中檢測(cè)到人生長(zhǎng)激素DNA序列 D酵母菌細(xì)胞中提取到人干擾素蛋白D3、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫A BC DD4、（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括A目的基因 B啟動(dòng)子 C終止子 D標(biāo)記基因ABCD5、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是A啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼B啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRN

16、A的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A6、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是A.人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C 例1 （08年全國(guó)卷理綜1）4.已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個(gè)酶切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長(zhǎng)度的DNA片段。 現(xiàn)在多個(gè)上述線性DNA分子，若在每個(gè)DNA分子上至少有1個(gè)酶切位點(diǎn)被該

17、酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA片段種類(lèi)數(shù)是 A.3 B.4 C.9 D. 12 答案：C2(高考試題：2007全國(guó)理綜II)下列有關(guān)基因工程中限制內(nèi)切酶的描術(shù)，錯(cuò)誤的是A.一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列B.限制性內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C.限制性內(nèi)切酶能別和切割RNAD、限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取3、【生物現(xiàn)代生物技術(shù)專(zhuān)題】為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶

18、作用于 處。（填“a”或“b”）（2） 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)。該技術(shù)的核心是 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用 方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)去分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）41979年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。如右圖，請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題。(1)此圖表示的是采取_ _方法獲取_基因的過(guò)程。人工（反轉(zhuǎn)錄）胰島素目的基因(2)圖中DNA是以_ _為模板，_形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的基因。胰島素mRNA逆轉(zhuǎn)錄 (3)圖中代表的是_酶，在它的作