電泳技術(shù)醫(yī)學知識培訓課件

1、電泳技術(shù)醫(yī)學知識電泳技術(shù)醫(yī)學知識第一節(jié) 概述2電泳技術(shù)醫(yī)學知識第一節(jié) 概述2電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、電泳技術(shù)的概念在直流電場中，帶電粒子向與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。利用各種帶電粒子電泳速度不同，對物質(zhì)進行分離，然后對物質(zhì)進行定性和定量的分析方法稱為電泳分析法，也叫電泳技術(shù)。3電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、電泳技術(shù)的概念在直流電場中，帶電粒子向與其電性相反的電極二、電泳技術(shù)的分類電泳技術(shù)的分類方法有多種，可從分離目的、電場強度、電泳媒介、電泳裝置、緩沖液pH等不同角度進行分類。4電泳技術(shù)醫(yī)學知識二、電泳技術(shù)的分類電泳技術(shù)的分類方法有多種，可從分離目的、電（一）按照

2、電場強度的不同，分為常壓電泳和高壓電泳常壓電泳的電場強度一般在210V/cm（電壓在500V以下）高壓電泳的電場強度一般在20220V/cm（電壓在500V以上） 5電泳技術(shù)醫(yī)學知識（一）按照電場強度的不同，分為常壓電泳和高壓電泳5電泳技術(shù)醫(yī)（二）按照電泳媒介不同（有無支持物），分為自由電泳和區(qū)帶電泳1自由電泳 自由電泳的媒介為溶液（不用支持物），帶電粒子在溶液中自由移動，適用于生物細胞和生物大分子的電泳分離，如顯微電泳、等電聚焦電泳、密度梯度電泳等。6電泳技術(shù)醫(yī)學知識（二）按照電泳媒介不同（有無支持物），分為自由電泳和區(qū)帶電泳2區(qū)帶電泳 媒介為支持介質(zhì)，被分離的物質(zhì)經(jīng)電泳后在支持介質(zhì)上形成區(qū)

3、帶稱為區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳是目前應用最廣泛的一種電泳技術(shù)，適用于蛋白質(zhì)、核酸等標本的分離。區(qū)帶電泳根據(jù)支持介質(zhì)的不同又分為濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。7電泳技術(shù)醫(yī)學知識2區(qū)帶電泳 媒介為支持介質(zhì)，被分離的物質(zhì)經(jīng)電泳后在支持介（三）按照分離目的的不同，分為分析電泳和制備電泳。（四）按照支持物的裝置形式（電泳裝置）不同，分為水平電泳（支持物水平放置，最常用）和垂直電泳等。8電泳技術(shù)醫(yī)學知識（三）按照分離目的的不同，分為分析電泳和制備電泳。8電泳技術(shù)（五）按照緩沖液pH值是否均一分為連續(xù)pH電泳和不連續(xù)pH電泳。1連續(xù)pH電泳 支持介質(zhì)各處的pH相同，如濾紙電泳

4、、醋酸纖維素薄膜電泳等。2不連續(xù)pH電泳 支持介質(zhì)各處的pH不同，聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等。9電泳技術(shù)醫(yī)學知識（五）按照緩沖液pH值是否均一分為連續(xù)pH電泳和不連續(xù)pH電三、電泳技術(shù)的特點1凡是帶電物質(zhì)均可應用某一電泳技術(shù)進行分離，并可進行定性或定量分析。2分辨率高。3可在常溫下進行。4樣品用量少。5操作省時簡便。6設備簡單。10電泳技術(shù)醫(yī)學知識三、電泳技術(shù)的特點1凡是帶電物質(zhì)均可應用某一電泳技術(shù)進行分第二節(jié) 電泳技術(shù)的基本原理11電泳技術(shù)醫(yī)學知識第二節(jié) 電泳技術(shù)的基本原理11電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、電泳遷移率在溶液中，若能吸附帶電質(zhì)點或者帶有可解離基團的物質(zhì)在一定的pH條件下在直流電場

5、中收到所帶電荷相反的電極吸引而發(fā)生移動。根據(jù)Stoke定律，用Q表示顆粒帶電量，v表示電泳速度（cm/s），E表示電場強度（V/cm），顆粒半徑r，介質(zhì)粘度系數(shù)。v=EQ/(6r)12電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、電泳遷移率在溶液中，若能吸附帶電質(zhì)點或者帶有可解離基團的遷移率（）：帶電顆粒在單位電場強度下的電泳速度。=v/E=Q/(6r)各種帶電物質(zhì)在一定的條件下測得的遷移率是一物理常數(shù)。13電泳技術(shù)醫(yī)學知識遷移率（）：帶電顆粒在單位電場強度下的電泳速度。13電泳技表2-1 血清蛋白等電點與電泳遷移率血清蛋白 等電點 電泳遷移率cm2/(Vs) 分子量 白蛋白 4.84 5.910-5 69 0001-

6、球蛋白 5.06 5.110-5 200 0002-球蛋白 5.06 4.110-5 300 000-球蛋白 5.12 2.810-5 90 000150 000-球蛋白 6.857.30 1.010-5 156 000300 000 14電泳技術(shù)醫(yī)學知識表2-1 血清蛋白等電點與電泳遷移率血清蛋白 15電泳技術(shù)醫(yī)學知識15電泳技術(shù)醫(yī)學知識二 、影響電泳遷移率的因素（一）樣品被分離物質(zhì)的帶電荷量和電泳速度成正比。帶電荷量越多，電泳速度越快。若帶電量相同，分子量大的電泳速度慢。分子大小與電泳速度成反比。16電泳技術(shù)醫(yī)學知識二 、影響電泳遷移率的因素（一）樣品16電泳技術(shù)醫(yī)學知識（二）電場強度電場

7、強度也稱電勢梯度，是指單位長度（每1cm）的電壓降（電位降）。常壓電泳的電場強度一般為210 V/cm，高壓電泳的電場強度一般為20200V/cm。常壓電泳多用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，高壓電泳則用來分離氨基酸、小肽、核苷等小分子物質(zhì)。電泳速度與支持介質(zhì)兩端的電壓成正比。17電泳技術(shù)醫(yī)學知識（二）電場強度17電泳技術(shù)醫(yī)學知識例如：以濾紙作支持物，其兩端浸入電極緩沖液中，電極緩沖液與濾紙交界面的紙長20cm，測得的電壓降為200V，那么，電場強度為200V/20cm=10V/cm。18電泳技術(shù)醫(yī)學知識例如：以濾紙作支持物，其兩端浸入電極緩沖液中，電極緩沖液與濾（三）電泳緩沖液電泳緩沖液起著決定粒

8、子電荷性質(zhì)和電荷量的作用，同時起導電作用，電泳時對緩沖液的化學組成、pH值和離子強度都有一定的要求。19電泳技術(shù)醫(yī)學知識（三）電泳緩沖液19電泳技術(shù)醫(yī)學知識1緩沖液的化學組成（緩沖溶質(zhì)） 緩沖體系的組成常選用弱酸/弱酸鹽、酸式鹽/次級鹽。對緩沖液的要求是化學性質(zhì)穩(wěn)定、電導率低、緩沖容量大、粒子移動性好。按此要求，緩沖液的pH值確定后，第一，選擇緩沖液時要盡量選擇pKa接近緩沖液pH的弱酸成分，此時緩沖容量最大。第二，優(yōu)先選用離子價數(shù)為1價的電解質(zhì)，目的是保持離子的活度。第三，優(yōu)先選擇正、負離子移動速度相近的電解質(zhì)，使電泳時離子分布均勻，保證電泳區(qū)帶的整齊。20電泳技術(shù)醫(yī)學知識1緩沖液的化學組成

9、（緩沖溶質(zhì)） 緩沖體系的組成常選用弱酸常用的緩沖液有巴比妥/巴比妥鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、NaH2PO4/Na2HPO4、Tris/HCL等。巴比妥/巴比妥鈉是血清蛋白電泳常用的電泳緩沖液。21電泳技術(shù)醫(yī)學知識常用的緩沖液有巴比妥/巴比妥鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、NaH2P2pH值 溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。如緩沖溶液的pH值大于待分離的蛋白質(zhì)的等電點pI，則蛋白質(zhì)帶負電荷，在電場中向正極移動。當分離某一蛋白質(zhì)混合物時，應選擇一種能擴大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值，以利于各種蛋白質(zhì)的分離，當然不能過酸過堿，以免引起蛋白質(zhì)變性。緩沖液的pH值一般設在4.5

10、9.0為宜。22電泳技術(shù)醫(yī)學知識2pH值 溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了3離子強度 除了要求緩沖液具有合適的化學組成和pH值以外，還要求具有一定的導電能力。緩沖液的導電能力可用離子強度表示。在稀溶液中離子強度可用下式計算：I=CiZi2/2I：離子強度，Ci：離子的濃度，Zi：離子的價數(shù)，代表累加。23電泳技術(shù)醫(yī)學知識3離子強度 除了要求緩沖液具有合適的化學組成和pH值以外例：求0.015M Na2SO4溶液的離子強度：I=（0.015212+0.01522）/2=0.045（mol/L）緩沖液的離子強度影響緩沖容量、產(chǎn)熱效應和電泳速度。離子強度大，緩沖容量大，pH值穩(wěn)定；但離

11、子強度大，電泳速度慢；同時離子強度大，電流強度大，產(chǎn)熱多，蒸發(fā)快。速度慢，會導致時間過長，標本擴散。速度快，導致區(qū)帶不整齊，分辨率低。綜合考慮，離子強度最好選在0.020.2mol/L之間。24電泳技術(shù)醫(yī)學知識例：求0.015M Na2SO4溶液的離子強度：24電泳技術(shù)（四）支持介質(zhì)支持介質(zhì)對電泳的影響主要表現(xiàn)為電滲作用和吸附作用。1電滲作用 液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動，稱為電滲作用。在電泳時應盡量避免使用具有高電滲作用的支持物。2吸附作用 支持介質(zhì)的表面對被分離的物質(zhì)具有一定的吸附作用，使被分離樣品滯留而降低電泳速度，造成樣品拖尾，使電泳的分辨率降低。電泳時，要選擇吸附作用小的

12、支持介質(zhì)。25電泳技術(shù)醫(yī)學知識（四）支持介質(zhì)25電泳技術(shù)醫(yī)學知識（五）溫度電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大影響。溫度每升高1，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，或安裝冷卻散熱裝置。（六）分子的性質(zhì)和形狀（七）蒸發(fā)26電泳技術(shù)醫(yī)學知識（五）溫度26電泳技術(shù)醫(yī)學知識第三節(jié) 電泳儀電泳儀是進行電泳分析的儀器主要由電源和電泳槽兩部分組成27電泳技術(shù)醫(yī)學知識第三節(jié) 電泳儀電泳儀是進行電泳分析的儀器27電泳技術(shù)醫(yī)學知一、電源電源是產(chǎn)生電泳電場的裝置，常為可調(diào)式直流電源。一般都用交流電源經(jīng)過整流、濾波后獲得，主要部分是一個整流器，可用晶體管、電子管或可控硅整流。多

13、數(shù)裝有穩(wěn)壓裝置，用電壓表和電流表指示輸出電壓及電流的大小。 28電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、電源電源是產(chǎn)生電泳電場的裝置，常為可調(diào)式直流電源。一般都二、電泳槽電泳槽是用來盛裝緩沖液和進行電泳的場所，多用透明塑料膜壓或用有機玻璃膠合而成。電泳槽外形有水平式、垂直式和圓盤式等多種，其中水平式電泳槽一般由電極、緩沖液槽、電泳介質(zhì)支架和一個透明的絕緣蓋等幾部分組成。電極分別裝在兩個緩沖液槽內(nèi)。電極應具有良好的導電性、抗腐蝕性和抗電解作用，常用鉑絲或鎳鉻合金絲等材料。29電泳技術(shù)醫(yī)學知識二、電泳槽電泳槽是用來盛裝緩沖液和進行電泳的場所，多用透明塑支持介質(zhì)放在兩個支架上，其兩端與電泳液接通而形成鹽橋。通電后，電流

14、只能在支持介質(zhì)體上通過，電泳物質(zhì)在其上泳動。絕緣蓋起防止緩沖液蒸發(fā)以及防觸電的保護作用。有些電泳槽有冷卻裝置以保證電泳介質(zhì)的溫度不至過高。電泳操作一般有支持介質(zhì)的制備或飽和，加樣，電泳分離樣品、染色及洗脫比色或光密度掃描定量等步驟。30電泳技術(shù)醫(yī)學知識支持介質(zhì)放在兩個支架上，其兩端與電泳液接通而形成鹽橋。通電后第四節(jié) 幾種常用電泳技術(shù)31電泳技術(shù)醫(yī)學知識第四節(jié) 幾種常用電泳技術(shù)31電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose acetate electrophoresis,CAE）是以醋酸纖維素薄膜作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜是將纖維素的羥基乙酰

15、化形成纖維素醋酸酯，然后將其溶于有機溶劑后涂抹成均勻的薄膜，干燥后就成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，厚度約為120m，通透性好，對分子移動阻力少，是一種良好的電泳支持物。32電泳技術(shù)醫(yī)學知識一、醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose（一）優(yōu)點1吸附作用和電滲作用都很小 2分離速度快 3分離區(qū)帶清晰，分辨率高 4樣品用量少 5操作簡便6易定量、可長期保存 33電泳技術(shù)醫(yī)學知識（一）優(yōu)點1吸附作用和電滲作用都很小 33電泳技術(shù)醫(yī)學知（二）缺點1薄膜吸水性差 2分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低3不適于制備34電泳技術(shù)醫(yī)學知識（二）缺點1薄膜吸水性差 34電泳技術(shù)醫(yī)學知識【

16、實驗名稱】醋酸纖維素薄膜電泳分離血漿蛋白質(zhì)【實驗原理】 血漿中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血漿中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白，纖維蛋白原條區(qū)帶。（三）操作步驟35電泳技術(shù)醫(yī)學知識【實驗名稱】醋酸纖維素薄膜電泳分離血漿蛋白質(zhì)（三）操作步驟3（三）操作步驟處理膜點樣電泳染色漂洗透明測定吸光度 36電泳技術(shù)醫(yī)學知識（三）操作步驟處理膜點樣電泳染色漂洗透明測定吸光操作步驟1、薄

17、膜準備 將醋酸纖維素薄膜切成28cm的小條。 在薄膜粗面一端1.5cm處用鉛筆輕輕畫一橫線。 在薄膜角上用鉛筆作一標記。 將醋酸纖維素薄膜浸泡于緩沖液中20min。 37電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟1、薄膜準備37電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置8cm2cm點樣線點樣區(qū)1.5cm(粗面）38電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置8cm2cm點樣線點樣區(qū)操作步驟2、電泳儀準備 在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個電極槽內(nèi)的液面等高。先剪裁尺寸合適的濾紙條，取雙層濾紙條附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對齊，而另一端浸入電極槽的緩沖液內(nèi)。用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅(qū)除

18、氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為濾紙橋。它是聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的“橋梁”。 39電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟2、電泳儀準備39電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟3、點樣（電泳的關(guān)鍵步驟） 用鑷子把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層濾紙中間，吸去多余的液體，然后平鋪在玻璃板上（粗面朝上），將點樣器先在培養(yǎng)皿的血漿中沾一下，再在膜條點樣線處輕輕地水平落下并隨即提起，這樣即在膜條上點上了細條狀的血漿樣品。 點樣線盡量點得細窄而均勻。寧少勿多。40電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟3、點樣（電泳的關(guān)鍵步驟）40電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟4、上槽 待血漿吸入膜后，以薄膜粗面向下、點樣端置陰極端，兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應輕

19、輕拉平，加蓋，平衡約5min，使薄膜滲透的緩沖液達到平衡。 切勿使點樣處與電泳槽接觸41電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟4、上槽41電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟5、電泳 檢查電泳裝置是否正確，開啟電源，調(diào)節(jié)電壓、電流，然后通電4060min。 電壓：110130V（10V/cm膜長） 薄膜的有效長度是兩電極緩沖液面之間濾紙鹽橋和薄膜的長度之和。 電流：0.40.6mA/cm膜寬 有數(shù)條膜便求數(shù)條膜寬的總和。 42電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟5、電泳42電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟6、染色和漂洗 電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換23次

20、），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。43電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟6、染色和漂洗43電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟血漿蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜電泳方向A12纖維蛋白原44電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟血漿蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜電泳方向A1操作步驟7、透明 薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平貼在玻璃板上（不要留有氣泡），完全干燥后即成透明的薄膜圖譜，要作掃描或照相用?？砷L期保存。45電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟7、透明45電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟8、定量（略） 洗脫比色法 光密度計掃描法46電泳技術(shù)醫(yī)學知識操作步驟8、定量（略）46電泳技術(shù)醫(yī)學知識血清蛋白電泳 光密度掃描47電泳

21、技術(shù)醫(yī)學知識血清蛋白電泳 光密度掃描47電泳技術(shù)醫(yī)學知識（五）應用醋酸纖維素薄膜電泳已廣泛用于各種生物分子的分離分析中，如血紅蛋白、血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶及類固醇等的分離和測定。48電泳技術(shù)醫(yī)學知識（五）應用醋酸纖維素薄膜電泳已廣泛用于各種生物分子的分離分析 正常人血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳示意圖 49電泳技術(shù)醫(yī)學知識49電泳技術(shù)醫(yī)學知識二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis,AGE）是以瓊脂糖凝膠作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳的吸附作用和電滲作用均較小，分辨率和重現(xiàn)性較好，電泳圖譜清晰，電泳速度快，區(qū)帶易染色

22、、洗脫和定量，常用于生物大分子如：血漿脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片段的分離。50電泳技術(shù)醫(yī)學知識二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel e三、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。這種凝膠電泳的主要特點是凝膠具有電泳和分子篩的雙重作用，大大提高了分辨能力。聚丙烯酰胺凝膠電泳能精細分離各種蛋白質(zhì)，還可測定蛋白質(zhì)和核酸的分子量，進行核酸的序列分析等，特別在基因變異或同工酶的研究中應用廣泛。51電泳技術(shù)醫(yī)學知識三、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝

23、膠電泳（polyacryl52電泳技術(shù)醫(yī)學知識52電泳技術(shù)醫(yī)學知識（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點1具有分子篩作用，分離效果好。2設備簡單，樣品用量少（1100微克），不易擴散，分辨率高。3不帶電荷，幾乎沒有電滲作用。4可通過控制凝膠濃度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，以適合不同分子量樣品的分離。5化學穩(wěn)定性好，由于分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基，聚丙烯酰胺凝膠是一種穩(wěn)定的親水膠體。6機械強度好，有彈性，無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。53電泳技術(shù)醫(yī)學知識（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點1具有分子篩作用，分離效果好不足之處是聚丙烯酰胺凝膠單體對神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚有毒性作用，但聚合后就沒有毒性了。54電泳技術(shù)醫(yī)學知識不足

24、之處是聚丙烯酰胺凝膠單體對神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚有毒性作用，但聚電泳技術(shù)醫(yī)學知識培訓課件56電泳技術(shù)醫(yī)學知識56電泳技術(shù)醫(yī)學知識過硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED）為化學催化系統(tǒng)。當在丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的溶液中加入這種催化系統(tǒng)后，過硫酸銨作為引發(fā)劑提供自由基，通過自由基傳遞，形成丙烯酰胺自由基從而引發(fā)聚合反應。四甲基乙二胺作為加速劑，可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度，具體反應為過硫酸銨在溶液中形成過硫酸自由基（SO4），該自由基可激活加速劑，加速劑作為電子載體提供一個未配對電子將丙烯酰胺單體轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺自由基，經(jīng)反應多聚物聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚合的速度與溫度成正比，如溫度過低，或體系中有氧分子及不

25、純物質(zhì)都會延緩凝膠的聚合。為了防止溶液氣泡中含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前最好先將溶液分別抽氣除氧，再混合配制。 57電泳技術(shù)醫(yī)學知識過硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED）為化學催化系統(tǒng)。當在丙烯核黃素TEMED為光催化系統(tǒng)，在光照下部分核黃素被還原成無色核黃素，在有痕量氧存在的條件下，無色核黃素再被氧化為帶有自由基的核黃素，從而引發(fā)聚合反應，在此系統(tǒng)中，核黃素是引發(fā)劑，四甲基乙二胺是加速劑。58電泳技術(shù)醫(yī)學知識核黃素TEMED為光催化系統(tǒng)，在光照下部分核黃素被還原成無（三）聚丙烯酰胺凝膠孔徑和機械強度的調(diào)節(jié)聚丙烯酰胺凝膠的孔徑、機械強度、彈性和透明度都與凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）有關(guān)。T表示

26、每100ml凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)（g/dl）。C則表示凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總克數(shù)的百分比。59電泳技術(shù)醫(yī)學知識（三）聚丙烯酰胺凝膠孔徑和機械強度的調(diào)節(jié)聚丙烯酰胺凝膠的孔徑凝膠的孔徑主要由T決定，也與C有關(guān)。T值越大，凝膠孔徑越小。當T值固定不變，C值在5%時，凝膠孔徑最小，大于或小于5%時凝膠的孔徑都會增大。在電泳中凝膠的孔徑是一個重要因素，往往會對分離效果起決定作用。常用于分離血漿蛋白的聚丙烯酰胺凝膠是標準凝膠，T為7.5 g/dl ，孔徑大約為5nm，適用于分子量104106的蛋白質(zhì)的分離。在科研工作中，一般是先進行預實驗，以選出最適的凝膠濃度。60電泳技術(shù)醫(yī)學知識

27、凝膠的孔徑主要由T決定，也與C有關(guān)。T值越大，凝膠孔徑越小。凝膠的機械強度、彈性和透明度主要取決于T及單體與交聯(lián)劑的比值。通常T值越大，機械強度越強，其中單體與交聯(lián)劑的比值尤為重要。實驗表明，T2.5g/dl，不能成膠；T15g/dl，凝膠的硬度、脆性增加，易于折斷。單體與交聯(lián)劑的比值小于10，交聯(lián)度過大，凝膠堅硬易碎，顏色乳白不透明；單體與交聯(lián)劑的比值大于100，凝膠又過軟，難以成形。一般T為510g/dl，單體與交聯(lián)劑的比值為2040，可制得彈性較好，軟硬適中，無色透明的凝膠。61電泳技術(shù)醫(yī)學知識凝膠的機械強度、彈性和透明度主要取決于T及單體與交聯(lián)劑的比值（四）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳一般在內(nèi)徑為0.7厘米，長10厘米的小玻璃管內(nèi)，把三種性質(zhì)不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來：樣品膠在最上層，濃縮膠在中層，分離膠在最下層。其中樣品膠和濃縮膠的緩沖液、pH值和孔徑大小完全一樣，區(qū)別是樣品膠中有樣品，而濃縮膠中沒有樣品。分離膠的孔徑一般比前兩種小，pH值也不相同。 62電泳技術(shù)醫(yī)學知識（四）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳62電泳技術(shù)醫(yī)學知識 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的電泳器示意圖 63電泳技術(shù)醫(yī)學知識63電泳技術(shù)醫(yī)學知識表2-2 血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件 凝膠總濃度 交聯(lián)劑百分比 Tris-HCl緩沖液 凝膠孔徑 主要效應 T（%） C