染色質(zhì)免疫沉淀及其測序培訓(xùn)課件

1、染色質(zhì)免疫沉淀及其測序染色質(zhì)免疫沉淀及其測序目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應(yīng)用優(yōu)缺點測序染色質(zhì)免疫沉淀及其測序2目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應(yīng)用優(yōu)缺點測序染色質(zhì)免疫沉淀及其測序一、簡介ChIP 是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關(guān)系。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序3一、簡介ChIP染色質(zhì)免疫沉淀及其測序3二、原理染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）的基本原理是在活細胞狀態(tài)下把細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和 DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色

2、質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序4二、原理染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin 染色質(zhì)免疫沉技術(shù)示意圖染色質(zhì)免疫沉淀及其測序5技術(shù)示意圖染色質(zhì)免疫沉淀及其測序5三、技術(shù)流程具體操作流程染色質(zhì)免疫沉淀及其測序6三、技術(shù)流程具體操作流程染色質(zhì)免疫沉淀及其測序6染色質(zhì)免疫沉淀及其測序培訓(xùn)課件2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min。每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。(不同樣本都進行超聲條件優(yōu)化實驗)3.14000rpm離

3、心10min(4)，轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序82、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10m3、免疫沉淀蛋白和DNA復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序93、免疫沉淀蛋白和DNA復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序94、收獲免疫復(fù)合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）染色質(zhì)免疫沉淀及其測序104、收獲免疫復(fù)合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）染色質(zhì)免疫沉淀及其5、洗脫免疫復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序115、洗脫免疫復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序116、去除甲醛交聯(lián)解交聯(lián)：加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M).混勻, 65,解交聯(lián)過夜。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序126、去除甲

4、醛交聯(lián)解交聯(lián)：加入20ul 5M NaCl（NaC7、DNA純化1、酚-氯仿抽提2、硅膠柱純化染色質(zhì)免疫沉淀及其測序137、DNA純化1、酚-氯仿抽提染色質(zhì)免疫沉淀及其測序138、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定1.如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法染色質(zhì)免疫沉淀及其測序148、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的四、應(yīng)用1.組蛋白修飾研究2

5、.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥物開發(fā)研究4.有絲分裂研究5.DNA損傷與凋亡分析染色質(zhì)免疫沉淀及其測序15四、應(yīng)用1.組蛋白修飾研究染色質(zhì)免疫沉淀及其測序15五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實情況，可以找出生理條件下某個DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點，從而反映體內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。缺點：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難以獲得；為了獲得高等豐度的結(jié)合片段，必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標蛋白質(zhì)的表達情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因獲取可能需要限制在組織來源。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序16五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真注意事項1、抗體與目的蛋白結(jié)合的有效性和

6、特異性ChIP所選擇的目的蛋白的抗體是 ChIP實驗成功的關(guān)鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。所以不是所有的抗體都能做 ChIP實驗的，只有經(jīng)過 ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結(jié)果的可靠性。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序17注意事項1、抗體與目的蛋白結(jié)合的有效性和特異性染色質(zhì)免疫沉淀2、交聯(lián)的條件交聯(lián)所用的甲

7、醛終濃度約為 1%，而交聯(lián)時間需要預(yù)實驗來確定。通常的交聯(lián)條件為室溫10 min。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序182、交聯(lián)的條件染色質(zhì)免疫沉淀及其測序183、超聲片段的大小打斷后的染色質(zhì)片段的長度應(yīng)主要集中在200-1000bp 左右。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序193、超聲片段的大小染色質(zhì)免疫沉淀及其測序19六、測序ChIP-Seq的原理是： 首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序20六、測序ChIP-Seq的原理是：染色質(zhì)免疫沉淀及其測序20應(yīng)用領(lǐng)域（1）判斷 DNA鏈的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾； （2）檢測RNA poly