環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的檢測課件

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的雌激素效應(yīng)檢測 內(nèi)分泌干擾物簡介內(nèi)分泌干擾物：天然動(dòng)物性雌激素雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和作為藥物使用的人工合成雌激素己烯雌(DES)、乙炔基雌二醇(EE2)、戊酸雌二醇(EV)。分子結(jié)構(gòu)具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的居多, 分子量150400之間。分子結(jié)構(gòu)和分子大小與生物體內(nèi)的激素相似。性質(zhì)大多數(shù)是脂溶性化合物, 分子中不含有強(qiáng)的水溶性基因, 因此較易溶于油脂類物質(zhì)中, 水中溶解度較小。性質(zhì)比較穩(wěn)定，具有難分解性, 不易生物降解, 可通過食物鏈進(jìn)入體內(nèi)并富集。環(huán)境中大量存在的內(nèi)分泌干擾物可能危害人類和野生動(dòng)物內(nèi)分泌、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)的正常功能并導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、生長發(fā)育異常

2、、出生缺陷和腫瘤的發(fā)生率增加、生殖能力下降等，從而嚴(yán)重影響人類的生存與發(fā)展。國內(nèi)率先開始研究的是1997年中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。目的和意義本研究目的在于了解水體中內(nèi)分泌干擾物DES、E1、E2、EE2、E3和EV 6種雌激素的存在及含量，以期為該類物質(zhì)的進(jìn)一步生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)研究方法魚類卵黃蛋白原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)法重組基因酵母檢測法酵母雙雜交法檢測方法檢測卵黃蛋白原的方法有多種, 常用的有3 種: 放射性免疫測定法(R IA )、酶聯(lián)免疫法(EL ISA ) 和蛋白吸印免疫檢測法(W estern B lo t t ing)。檢測方法放射性免疫測定法：使用 32P

3、 和 3H 標(biāo)記的亮氨酸; 對不同魚種類都有效; 靈敏、定量、特異性; 靈敏檢測限為0.001 mol/mL , 常規(guī)檢測限為0.01 mol/mL 酶聯(lián)免疫法：使用單克隆或多克隆抗體;不同魚種類有特異性; 在適當(dāng)?shù)南♂尫秶苍试S定量; 檢測限為0.1 mol/mL 蛋白吸印免疫檢測法：能準(zhǔn)確確定蛋白質(zhì), 但定量方面較弱重組基因酵母檢測法原理：酵母細(xì)胞一般不含雌激素受體(ER )。重組基因酵母檢測法是將人類雌激素受體(hER) 的DNA 片段整合到酵母基因組中的雌激素應(yīng)答表達(dá)子(ERE) 質(zhì)粒上。這個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上還帶有能編碼-半乳糖苷酶的報(bào)告基Lac2Z。在這個(gè)系統(tǒng)中,hER 以一種能夠與ERE

4、 結(jié)合的形式被表達(dá)。ERE序列位于表達(dá)質(zhì)粒上的一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子序列之中。在結(jié)合一個(gè)活性配體之后, 與雌激素結(jié)合的受體就會(huì)與轉(zhuǎn)錄因子和其他轉(zhuǎn)錄成分反應(yīng)來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄, 這就引起了報(bào)告基因Lac2Z 的表達(dá),產(chǎn)生的-半乳糖苷酶就會(huì)分泌到介質(zhì)中(圖1)。在介質(zhì)里, -半乳糖苷酶使能發(fā)色的酶作用物-D-吡喃半乳糖苷氯酚紅(CPRG, 通常為黃色) 產(chǎn)生代謝變化, 變成紅色, 能在540nm測吸光率。通過檢測-半乳糖苷酶的量就可以定量檢測出化學(xué)品的類雌激素活性。反應(yīng)式及計(jì)算公式酵母雙雜交法重組基因酵母法僅僅把人類雌激素受體(hER) 的DNA片段整合到酵母的基因組中; 而酵母雙雜交法則在此基礎(chǔ)之上, 把輔激活蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。雌激素濃度的分析雌激素效應(yīng)的檢測是有