重組DNA重點(diǎn)技術(shù)

1、遺傳工程也叫基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)或重組DNA技術(shù) (recombination DNA technique)是 20世紀(jì)70年代后來(lái)興起日勺一門(mén)新技術(shù)其重要原理是用人工 日勺措施把生物日勺遺傳物質(zhì)一般是脫氧核糖核酸(DNA)分離出來(lái)在體外進(jìn)行基因切割連接重組轉(zhuǎn) 移和體現(xiàn)勺技術(shù)基因勺轉(zhuǎn)移已經(jīng)不再限于同一類物種之間動(dòng)物植物和微生物之間都可進(jìn)行基因 轉(zhuǎn)移變化宿主遺傳特性發(fā)明新品種系或新勺生物材料基因工程是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作日勺復(fù)雜技術(shù)，一般波及4個(gè)環(huán)節(jié)ini11%示 M 禾影SiRrr.；上赤 :一是克隆目勺勺基因，獲得所

2、需要日勺-DNA特異片段;二是將目日勺基因與DNA載體連接成重組 DNA;三是將重組DNA引入細(xì)菌或動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)使其增殖;四是將體現(xiàn)目日勺基因勺受體細(xì)胞挑選 出來(lái)，使目日勺基因體現(xiàn)相應(yīng)勺蛋白質(zhì)或其她產(chǎn)物，從而育成動(dòng)植物優(yōu)良新品種(系)。自1977年成功地用大腸桿菌生產(chǎn)出生長(zhǎng)Itl釋放克制因子以來(lái)，人胰島素、人生長(zhǎng)激素、胸腺 肽、干擾素、尿激酶、腫瘤壞死因子、瘋牛病疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗、 幼畜腹瀉疫苗和青霉素?；富蚬こ叹甑葦?shù)十種基因工程產(chǎn)品相繼問(wèn)世。優(yōu)質(zhì)產(chǎn)毛羊等動(dòng) 物新品種，金色水稻，抗蟲(chóng)或抗除草劑日勺玉米、大豆、棉花、水稻，轉(zhuǎn)類胡蘿卜素生物合成有 關(guān)酶基因花卉、蔬菜等

3、已獲推廣或已獲得階段性成果。廣義日勺遺傳工程波及細(xì)胞水平上日勺遺傳操作(細(xì)胞工程)和分子水平上日勺遺傳操作，即重組DNA 技術(shù)(有人稱之為基因工程)。狹義勺遺傳工程則專指后者。簡(jiǎn)史重組DNA技術(shù)來(lái)源于兩個(gè)方面日勺基本理論研究-限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）和基因載體（簡(jiǎn) 稱載體）。限制酶勺研究可以追溯到1952年美國(guó)分子遺傳學(xué)家S.E.盧里亞在大腸桿菌中所發(fā)現(xiàn) 勺一種所謂限制現(xiàn)象-從菌株甲勺細(xì)菌所釋放勺噬菌體能有效地感染同重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù) 一菌株勺細(xì)菌，可是不能有效地感染菌株乙;少數(shù)被感染勺菌株乙勺細(xì)菌所釋放勺同一噬菌體能 有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。通

4、過(guò)長(zhǎng)期勺研究，美國(guó)學(xué)者W.阿爾伯在1974 年終于對(duì)這一現(xiàn)象提出理解釋，覺(jué)得通過(guò)噬菌體感染而進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞勺DNA分子能被細(xì)菌辨認(rèn) 而分解，細(xì)菌自身勺DNA則由于已被自己所修飾（甲基化）而免于被分解。但有少數(shù)噬菌體在沒(méi) 有被分解此前已被修飾了，這些噬菌體經(jīng)釋放后便能有效地感染同一菌株勺細(xì)菌。被甲（或乙） 這一菌株所修飾勺噬菌體只能有效地感染甲（或乙），而不能有效地感染乙（或甲），闡明各個(gè)菌株 對(duì)于外來(lái)DNA勺限制作用常常是專一性勺。通過(guò)進(jìn)一步勺研究發(fā)現(xiàn)這種限制現(xiàn)象是由于細(xì)菌細(xì) 胞中具有專一性勺限制性核酸內(nèi)切酶勺緣故。重組DNA技術(shù)中所用勺載體重要是質(zhì)粒和溫和噬菌體（見(jiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)）兩類，而在實(shí)際應(yīng)用中勺

5、載體幾 乎都是通過(guò)改造勺質(zhì)?；驕睾褪删w。英國(guó)微生物遺傳學(xué)家W.海斯和美國(guó)微生物遺傳學(xué)家J. 萊德伯格等在1952年一方面結(jié)識(shí)到大腸桿菌勺F因子（見(jiàn)細(xì)菌接合）是染色體外勺遺傳因子。1953年法國(guó)學(xué)者P.弗雷德里克等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌產(chǎn)生大腸桿菌素這一性狀為一種染色體外勺大 腸桿菌素因子所控制。1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。后兩類質(zhì)粒都是在遺傳工程中廣泛 應(yīng)用勺質(zhì)粒。重組DNA技術(shù)中廣泛應(yīng)用日勺噬菌體是大腸桿菌日勺溫和噬菌體入，它是在1951年由美國(guó)學(xué)者 E.萊德伯格等發(fā)現(xiàn)日勺。到70年代初，生物化學(xué)研究日勺進(jìn)展也為重組DNA技術(shù)奠定了基?972年美國(guó)勺分子生物學(xué)家 P.伯格等將動(dòng)物病毒SV40

6、日勺DNA與噬菌體P22日勺DNA連接在一起，構(gòu)成了第一批重組體 DNA分子。1973年美國(guó)日勺分子生物學(xué)家S.N.科恩等又將幾種不同日勺外源DNA插入質(zhì)粒 PSC101日勺DNA中，并進(jìn)一步將它們引入大腸桿菌中，從而開(kāi)創(chuàng)了遺傳工程勺研究。環(huán)節(jié)和措施折疊環(huán)節(jié)重組DNA技術(shù)一般波及四步:獲得目日勺基因;與克隆載體連接，形成新日勺重組DNA分子; 用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳;對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定。；對(duì) 獲得外源基因日勺細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需勺遺傳性狀或體現(xiàn)出所需要勺產(chǎn)物。在具體 工作中選擇哪條技術(shù)路線重要取決于基因日勺來(lái)源、基因自身勺性質(zhì)和該項(xiàng)遺傳工程日勺目日勺

7、。折疊措施重組DNA片段日勺獲得重要日勺措施有：運(yùn)用限制酶獲得具有粘性末端或平整末端勺DNA片段；用機(jī)械措施剪切獲得具有平整末端勺DNA片段，例如用超聲波斷裂雙鏈DNA分子；經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄酶勺作用從mRNA獲得與mRNA順序互補(bǔ)勺DNA單鏈，然后再?gòu)?fù)制形成雙鏈 DNA(cDNA)。例如人勺胰島素和血紅蛋白勺構(gòu)造基因都用這措施獲得。這樣獲得勺基因具有編 碼蛋白質(zhì)勺所有核苷酸順序，但往往與本來(lái)位置在染色體上勺基因在構(gòu)造上有區(qū)別，它們不具 有稱為內(nèi)含子勺不編碼蛋白質(zhì)日勺間隔順序(見(jiàn)基因)；用化學(xué)措施合成DNA片段。從蛋白質(zhì)肽鏈日勺氨基酸順序可以懂得它日勺遺傳密碼。根據(jù)這密碼 用化學(xué)措施可以人工合成基因。

8、重組DNA技術(shù)技術(shù)路線DNA片段和載體日勺連接DNA片段和載體相連接日勺措施重要有四種：粘性末端連接，每一種限制性核酸內(nèi)切酶作用于DNA分子上勺特定勺辨認(rèn)順序，許多酶作用 勺成果產(chǎn)生具有粘性末端勺兩個(gè)DNA片段。例如來(lái)自大腸桿菌（Escherichia coli）勺限制酶 EcoRI作用于辨認(rèn)順序GAATTCCTTAAG-f （f批示切點(diǎn)），產(chǎn)生具有粘性末端七-CTTAA和AATTCG勺片段。把所要克隆勺DNA和載體DNA用同一種限制酶 解決后再經(jīng)DNA連接酶解決，就可以把它們連接起來(lái)。平整末端連接，某些限制性內(nèi)切酶作用勺成果產(chǎn)生不含粘性末端勺平整末端。例如來(lái)自副流 感嗜血桿菌（Hemophi

9、lus parainfluenzae）日勺限制酶Hpal作用于辨認(rèn)順序GTTAACCAATTG而產(chǎn)生末端為“CTT GAA日勺DNA片段。用機(jī)械剪切措施獲得 日勺DNA片段日勺末端也是平整日勺。在某些連接酶（例如感染噬菌體T4后日勺大腸桿菌所產(chǎn)生日勺DNA 連接酶）日勺作用下同樣可以把兩個(gè)這樣勺DNA片段連接起來(lái)。同聚末端連接，在脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（也稱末端轉(zhuǎn)移酶）日勺作用下可以在DNA日勺3羧基端合 成低聚多核苷酸。如果把所需要勺DNA片段接上低聚腺嘌吟核苷酸，而把載體分子接上低聚胸 腺嘧啶核苷酸，那么由于兩者之間能形成互補(bǔ)氫鍵，同樣可以通過(guò)DNA連接酶日勺作用而完畢 DNA片段和載體間勺連接

10、。人工接頭分子連接，在兩個(gè)平整末端DNA片段日勺一端接上用人工合成日勺寡聚核苷酸接頭片 段，這里面包具有某一限制酶日勺辨認(rèn)位點(diǎn)。經(jīng)這一限制酶解決便可以得到具有粘性末端日勺兩個(gè) DNA片段，進(jìn)一步便可以用DNA連接酶把這樣兩個(gè)DNA分子連接起來(lái)。導(dǎo)入宿主細(xì)胞將連接有所需要勺DNA日勺載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞日勺常用措施有四種：轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒作載體所常用勺措施。轉(zhuǎn)染（見(jiàn)轉(zhuǎn)化），用噬菌體DNA作載體所用日勺措施，這里所用勺噬菌體DNA并沒(méi)有包上它勺 外殼。轉(zhuǎn)導(dǎo)，用噬菌體作載體所用勺措施，這里所用勺噬菌體DNA被包上了它日勺外殼，但是這外殼 并不是在噬菌體感染過(guò)程中包上，而是在離體狀況下包上勺，因此稱為離體包裝

11、。注射，如果宿主是比較大日勺動(dòng)植物細(xì)胞則可以用注射措施把重組DNA分子導(dǎo)入。選擇用以上任何一種措施連接起來(lái)勺DNA中既也許波及所需要勺DNA片段，也也許波及并不需要 日勺片段，甚至波及互相連接起來(lái)日勺載體分子勺聚合體。因此接受這些DNA日勺宿主細(xì)胞中間只有 一小部分是真正具有所需要勺基因勺。一般通過(guò)3種措施可以獲得所需要勺宿主細(xì)胞:遺傳學(xué) 措施，對(duì)于帶有抗藥性基因日勺質(zhì)粒來(lái)講，從被轉(zhuǎn)化細(xì)菌與否由敏感狀態(tài)變?yōu)榭顾幦丈谞顟B(tài)就可以 懂得它有無(wú)獲得這一抗藥性質(zhì)粒。一種抗藥性基因中間如果接上了一段外來(lái)勺DNA片段，就使 獲得這一質(zhì)粒勺細(xì)菌不再體現(xiàn)抗性重組DNA技術(shù)。把一種帶有兩個(gè)抗性基因氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性勺質(zhì)粒pBR322用限制酶Bam