糖化酶的生產(chǎn)流程設(shè)計(jì)方案說明

1、糖化酶的生產(chǎn)流程設(shè)計(jì)方案糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - 葡聚糖葡聚糖水解酶,EC. 3. 2. 1. 3) 是淀粉糖化工藝的主要酶類,被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等工業(yè)。目前,糖化酶的生產(chǎn)菌種主要為黑曲霉。根據(jù)使用的生產(chǎn)菌種不同及發(fā)酵工藝不同,工業(yè)生產(chǎn)中,糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平在35 00055 000UPmL不等。糖化酶的工業(yè)化生產(chǎn)從過去的固體發(fā)酵沿革到上世紀(jì)90年代初液體發(fā)酵工藝逐步取代了原固體發(fā)酵工藝。液體發(fā)酵工藝的建立與應(yīng)用極大地改善了發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量并大幅度提升了糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平。但現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)共同存在不足之處,其中種子制備周期和發(fā)酵生產(chǎn)周期很長是一個(gè)較突出的問題,如實(shí)

2、驗(yàn)室的種子制備需要15d,發(fā)酵周期通常200h以上。生產(chǎn)流程圖一、 試驗(yàn)菌種的分純1、 培養(yǎng)基（1）固體培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基+1酵母膏+12）初篩培養(yǎng)基，玉米粉：麩皮：米糠：硫酸胺=7:3:2:0.16 （3）誘變后培養(yǎng)基，玉米粉：麩皮：米糠：硫酸胺=8：3:1.5:2:0.16，水80ml。（2）原料：玉米粉、麩皮等（3）菌種分純將麩皮采集菌種取出一部分，置入裝有 10mL 生理鹽水和若干玻璃珠的小三角瓶?jī)?nèi)，振蕩15 分鐘，將上清液一次稀釋成10 、10 、10 ，各取 0.1mL 做平板劃線，29培養(yǎng) 56 天，分別挑取單個(gè)菌落接入斜面，29培養(yǎng)一周。以大連某廠的生產(chǎn)用菌 B-11 為對(duì)照，

3、對(duì)分離菌株做搖床發(fā)酵試驗(yàn)，96h后測(cè)定糖化力，配合鏡檢，確定誘變的出發(fā)菌株。二、試驗(yàn)菌株的誘變用生理鹽水洗下成熟出發(fā)株的孢子、倒入5mL麥汁種1酵母膏的三角瓶中，振蕩1.5h，使孢子活化，后3500r/min.離心分離15 pH7.2 5ML洗轉(zhuǎn)入小三角瓶?jī)?nèi)（內(nèi)有數(shù)枚無菌玻璃珠），振蕩 10 分鐘，使孢子分散均勻，過濾，制成單孢子懸浮液，將濃度調(diào)至10 /ml6取 10ml 孢子懸浮液于 9cm 平板中，紫外線（UV）照射誘變 2分鐘（避光操作），紫外線動(dòng)率15W，室溫，攪拌，照射距離30cm。向經(jīng)紫外線處理的菌液中加入硫酸二乙酯（DES）稀液（原液1ml95乙醇 4ml配制）0.1ml，32

4、恒溫處理 15分鐘，不斷搖動(dòng)平皿，處理后立即稀釋至 10 、10 （中止反應(yīng)），各取 0.10.2ml涂平板，29培養(yǎng)5天后挑取單菌接入試管。搖床發(fā)酵試驗(yàn)，優(yōu)選出糖化力高的新菌株UD-7等。三、糖化酶的制備(一材料：菌種：黑曲霉儀器：恒溫培養(yǎng)箱離心機(jī)水浴鍋恒溫液體振蕩培養(yǎng)器小型液體發(fā)酵罐分光光度計(jì)等試劑：鏈霉素0苯甲酸鈉乳酸氫氧化鈉硫酸銨等（二）設(shè)備LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；TGL-16C型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；1086型精密水浴鍋 德國GFL公司；HYG-II型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶機(jī) 上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠；UV-2100型紫外分光光度計(jì) UNICO

5、(儀器公司；LS-350L型立式壓力蒸氣滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；MP2000D型電子天平 (有限公司；DG-2B 多功能恒溫箱 上海醫(yī)療器械修造廠；超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司。()方法液體深層發(fā)酵工藝流程：試管斜面菌種一種子擴(kuò)大培養(yǎng)一液體深層通風(fēng)發(fā)酵一過濾一離心一干燥一粗酶制劑一酶活測(cè)定配方：斜面種子培養(yǎng)基：蔗糖30g硫酸銨3g磷酸氫鉀lg05g硫酸鐵0Olg1000ml液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基：玉米面。豆餅粉麥麩 Kel 5g水lO00ml自然PI-I通風(fēng)恒溫液體深層通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10 豆餅粉4 水lO00ml 51粗酶提取發(fā)酵液一過濾一鹽析一固形物一烘干一加入淀粉添充劑一磨粉一粗酶制劑。2酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定方法()5ml 3 瓊脂倒皿一再加5ml可溶性淀粉與3 瓊脂一放入三個(gè)滅過菌的鋼圈分別滴人不同濃度的酶液一定期測(cè)定透明圈直徑。()lOml 20 可溶性淀粉 5ml檸檬酸PH48 (對(duì)照不加酶液。處理加lm1)lml10NaOH終止反應(yīng)，對(duì)照補(bǔ)加lml酶液一濾紙過渡一比色。四、結(jié)果 與分析（一）結(jié)果1鋼圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：2DNS 測(cè)定結(jié)果如下表()分析強(qiáng)，易培養(yǎng)，所以菌種培養(yǎng)條件一般很好控制，不會(huì)受到污染，而發(fā)酵條件難以控制。這正是提高酶活的關(guān)鍵。據(jù)中科院