PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷常見非整倍體疾病中的臨床應(yīng)用

1、PCR 技術(shù)在產(chǎn)前診斷常見非整倍體疾病中的臨床應(yīng)用董小歡;賀靜【摘要】非整倍體疾病是類因染色體數(shù)量異常引起的綜合征,目前尚無有效的治療方法,產(chǎn)前診斷后終止妊娠是預(yù)防此類疾病患兒出生的可行措施.染色體核型分析是診斷該類疾病的金標(biāo)準(zhǔn),但細(xì)胞培養(yǎng)耗時較長.近年,PCR 技術(shù)在非整倍體疾病快速診斷應(yīng)用中發(fā)展迅速,具有試劑成本相關(guān)于較低、檢測批量大和快速的優(yōu)勢.本文訣別從定性、半定量、定量不同層次來探討PCR 及相關(guān)技術(shù)常見非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用.【期刊名稱】中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版）【年(卷),期】2010(002)003【總頁數(shù)】6 頁(P21-26)【關(guān)鍵詞】PCR;非整倍體;產(chǎn)前診斷【作

2、者】董小歡;賀靜【作者單位】昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院,云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心,云南昆明,650032; 昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院,云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心,云南昆明,650032【正文語種】中 文非整倍體疾病是一類因染色體數(shù)量異常引起的綜合征，目前尚無有效的治療方法。95以上的三體綜合征在出生前流產(chǎn)1?；町a(chǎn)兒中最常見的三體綜合征囊括 21- 三體綜合征（own Synrome ）、18- 三體綜合征（Ewars Synrome ）、13- 三 體 綜 合 征 （Patau Synrome ）、Klinefilter 綜合征，單體綜合征以Turner 綜合征最為常見。常染色體單體綜合征

3、簡直不能存活到足月分娩。存活的非整倍體疾病患者表現(xiàn)出不同程度的智力低下、給患者、家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。這些疾病目前尚無有效的治療方法，僅能 經(jīng)過產(chǎn)前篩查和（或）產(chǎn)前診斷后經(jīng)過選擇性人工流產(chǎn)措施避免此類患兒的出生。 染色體核型分析是診斷非整倍體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，它能提供準(zhǔn)確、豐富的信息量2。然而該技術(shù)耗時長，關(guān)于人員的操作技術(shù)要求高3 。熒光原位雜交技術(shù)雖無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，但染色體特異性探針的成本較高，每批次能檢測標(biāo)本的規(guī)模較小，而且勞動力密集2。聚合酶鏈反映（Polymerase，PCR）技術(shù)自20 世紀(jì)80 技術(shù)的發(fā)展，近年P(guān)CR技術(shù)在非整倍體疾病快速診斷應(yīng)用中發(fā)展迅速，比較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)

4、而言，PCR技術(shù)具有試劑成本相關(guān)于較低、檢測批量大和快速的優(yōu)勢。本文訣別從定性、半定量、定量不同層次，探討PCR及相關(guān)技術(shù)在常見非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。定性PCRSTR-PCR（ShortTanemRepeat 即微衛(wèi)星位26個堿基為單位串聯(lián)反復(fù)排列。STR一般遵循脫或者NA互補(bǔ)鏈堿基錯配導(dǎo)致反復(fù)單位的插入4。1991 年，Ewars 等5建立了 STR-PCR 分型技術(shù)。該法選用染色體上的 STR 位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯帶分型，根據(jù)條帶的數(shù)目及濃度判斷是否為三體綜合征。朱金玲等621 4 個STR位點(diǎn)（21S2055 、21S1244 、21S1

5、435 、21S1809 ）21- 三體， 并且可判定額外染色體的親代來源。王歡等721 號染色體關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)部及6 STR （21S11 、21S1412 、21S1437 、21S1413 、21S1446 、21S1270 ），5 21三體綜合征。2007 1 2009 12 5 STR 位點(diǎn)（21S11 、21S1437 、21S1411 、18S535 、18S1002 ），1 968 名孕婦進(jìn)行了快速19 例唐氏綜合征、10 18三體綜合征，其結(jié)果與染色體核型分析基本一致。STR-PCR 技術(shù)具有簡單、安全、成本低的優(yōu)點(diǎn)8。PCR 反映需選用具有高度多態(tài)性的STR 位點(diǎn)，當(dāng)胎兒在某位

6、點(diǎn)上為純合子時則無法提供診斷依據(jù)。本院診1 968 1 5 STR 位點(diǎn)上均表現(xiàn)為純合色體的來源，還可判斷染色體不分離發(fā)生的時間9。當(dāng)三體綜合征的實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 ：1：1 3 條帶時，提示減數(shù)分裂I 期同源染色體不分離；表現(xiàn)為1 ：2 2 II 期姐妹染色單體不分離。此外，本方法可以辨別標(biāo)本中是否存在母血污染，但關(guān)于于易位型或嵌合型的染色體 因此該方法終會被定量PCR所取代，以降低漏診率和假陰性。甲基化特異性PCR ，MSP）MSP法的原理是鑒于NA 經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，一切未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ? 關(guān)于針關(guān)于甲基化與非甲基化等位基因的引物，PCR 擴(kuò)增后聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)

7、增產(chǎn)物就可以將甲基化與非甲基化等位基因區(qū)分開。等10利用XFMR-1X染色體的倍性分析，并且設(shè)2 NA X染色體上CpG PCR 142 bp 的片段； Cp G 84 bp 的產(chǎn)物。在整個基因組中， Cp G 島通常位于基因的啟動子區(qū)域，在正常情況下，Cp G 島是以非甲基化形式1 X 染色體上的基1 X 染色體。在這種情況下，其啟動子區(qū)域的Cp G 島是甲基化142bp 84bp 284bp 15 號染色體上SNRPN CpG1例特納綜合20 42 例正常女性關(guān)于照進(jìn)行X染色體的倍性分析。研究結(jié)果顯示該種診斷方法靈敏度高，準(zhǔn)確率達(dá)100，而且該方法簡單易行、快速高效（48 小時以內(nèi)完成）、

8、準(zhǔn)確、并且無需使用昂貴的設(shè)備。該方法的建立為進(jìn)行X染色體的倍性分析提供了一條簡單易行的途徑，但是該方法是利用X染色體的失活來進(jìn)行檢測的，所以只能用于進(jìn)行X染色體的倍性分析。多連接依賴性探針擴(kuò)增probe，MLPA）MLPA 是一種高通量、針關(guān)于待測核酸中靶序列進(jìn)行定量分析的技術(shù)，基本原理囊括探針和靶序列NA 進(jìn)行雜交，之后經(jīng)過特異化連接，PCR 擴(kuò)增連接完得出產(chǎn)物峰的峰面積、峰高度，根據(jù)特定基因拷貝數(shù)的改變，即可確定染色體數(shù)目 的異常。an 等11 517 7 例表現(xiàn)為7MLPA7例樣本的核型。范新萍等1234 13、18、21、X和Y染色體拷貝數(shù)的33 份外周血、臍帶血或羊水標(biāo)本報(bào)告均與染色

9、體核型分析結(jié)果一致，臨床契合率 97.1% 。MLPA 是一種敏感性高、準(zhǔn)確性高、快速經(jīng)濟(jì)的診斷方法，但不能應(yīng)用于檢測被污染的羊水標(biāo)本，亦不能用于檢測STR 位點(diǎn)及染色體的平衡易位。半定量PCR引物原位標(biāo)記，PRINS）PRINS 是由細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)技術(shù)相接合形成的一種新技術(shù)，該技術(shù)將FISH與PCR接合起來，其基本原理是應(yīng)用寡核苷酸引物與變性后的染色體NA特異接合，然后用非同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸（UTP）參與延伸反映，標(biāo)記了的UTP將以堿基配關(guān)于的形式摻入新合成的NA單鏈中，最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)記物接合， 在熒光顯微鏡下觀察熒光信號。等13 262 例未培養(yǎng)的羊水標(biāo)本進(jìn)

10、行檢測，診斷其中2 18 三體，無假陽性及假陰性結(jié)果。劉楊等14 10 例典范三體型唐氏綜合征患者進(jìn)行基因診斷，結(jié)果均顯示 3 個鮮明的標(biāo)記信號。與FISH相比，該方法更快速、簡便（12小時，前者常需過夜）、價(jià)格低廉（費(fèi)用為FISH110），1321號染色體（FISH由于采用著絲粒探針，13 21 號染色體存在高度同源性故常發(fā)生交叉反映而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）， 多色PRINS 反映中每一個引物與靶序列的退火反映都在各自的最適溫度下進(jìn)行， 從而保證了其特異性15。同源基因定量PCR（HGQ-PCR）HGQ-PC法設(shè)計(jì)一關(guān)于公用引物，同時擴(kuò)增源基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的相關(guān)于比值并且統(tǒng)計(jì)分析其變異范圍，可

11、以檢測出非整倍體中增加的染色體的基因拷貝。王謙等16178 38 21 號（PFKLCH21）和位于 1 號染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM-CH1 ），2 組研究關(guān)于象的同源基因比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該方法需要使用光密度掃描儀，快捷、較QFPCR 法費(fèi)用低廉。除PCR 循環(huán)周期外，NA PCR擴(kuò)增的主要因素。如果NA 質(zhì)量太差，將僅能擴(kuò)增出較小的PFKL基因片段，而較大的PFKM 基因片段擴(kuò)增失敗17 。定量PCR實(shí)時熒光定量PCR）實(shí)時熒光定量PCR是指在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積淀實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)于未知模板進(jìn)行定量分析的方法。而在非整倍

12、體的中同時擴(kuò)增目的基因和管家基因，反映結(jié)束后訣別獲得兩基因的CT值，根據(jù)數(shù)學(xué)方法推導(dǎo)得出目的基因相關(guān)于于管家基因的量。高斌等18 21 號染色體上唐氏綜合征特異區(qū)域基因片段（SCR3）為目12 號染色體上的GAPH 為參照基因，設(shè)計(jì)引物以及訣別以不同熒光標(biāo)記的Taq Man 20 例經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分30 例正常血標(biāo)本，訣別獲得患者和正常人的CT值，兩組數(shù)據(jù)間有非常鮮明的差異，且無交叉重疊。余蓉等19應(yīng)12 號染色體上GAPH 基因、21 S100B 基因和SCR1 基因，比較得病歷組與關(guān)于照組 CT 值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且病歷組低于關(guān)于照組。Jerome等20同時擴(kuò)增非多態(tài)性目的基因SCR1 囊性纖

13、維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白），154 2 21三體，一切標(biāo)本的檢測結(jié)果均與核型分析一致。Tomoko 等21 同時擴(kuò)增目的基因鉀離子電壓門控通道基因（21q22.12 ）和內(nèi)參基因核糖體磷蛋白基因（18q21.1），2基因的CT值，唐氏綜合征的CT值鮮明高于正常關(guān)于照組，且兩者間無重疊。比較閾值法多選用非多態(tài)性的遺傳標(biāo)記（不同于QF-PCR STR位點(diǎn)）， 本低、通量大，但需優(yōu)化條件使目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率一致22 。該合型患者難以明確診斷，需要進(jìn)一步研究、完備。定量熒光PCR（QuantitativePCR，QF-PCR）QF-PCR 法經(jīng)過熒光標(biāo)記的引物，PCR 擴(kuò)增NA 樣本，經(jīng)毛細(xì)管電泳分

14、離擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)內(nèi)標(biāo)（相當(dāng)于NA marker ）的指示，軟件自動計(jì)算出檢測片段的信息（出峰時間、的STR 2 1：1；若為1 2 倍。江帆等2321 3 STR位點(diǎn)（21S1435 、21S1411 、21S11 ），X 染色體上的兩個STR位點(diǎn)（XS981 、XS6809 、Y染色體上共有的STR 位點(diǎn)X22 及性別特異性位點(diǎn)5 端標(biāo)記熒202 NA PCR 擴(kuò)增，使用PCR 結(jié)果分析，根據(jù)國際統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷，與染色體核型診斷結(jié)果具有同一性。等24 2000 6 2004 3 月英8 983 例標(biāo)本進(jìn)行了QF-PCR 18 例嵌合體，3 13三體、7 18三體、7 21三體、1

15、例嵌合三體。他們同時還發(fā)現(xiàn)聯(lián)用核型分析和QFPCR 比單用其中任一方法能檢測出更多的嵌合體。QF-PCR 法常選用高度多態(tài)性的STR 位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，當(dāng)胎兒在某位點(diǎn)上為純合子時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法提供診斷信息，此時就應(yīng)增加位點(diǎn)數(shù)以滿足診斷需要。Levett 等255000 2的78 個位點(diǎn)均表現(xiàn)為純合子，因此無法明確診斷。此外， 該方法診斷染色體異常疾病的靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以分析出異常染色體的雙親 1 2 期26。羊水中常見的少量母血污染并且不影響 QF-PCR，而大量的母血污染可能掩蓋胎兒的基因型。Celia 等24 認(rèn)為當(dāng)異常細(xì)胞株的比例不小于 15% 時，QF-PCR 才能檢測出嵌合體的

16、存在。數(shù)字 ）PCRNA樣本稀釋后分裝到芯片的每個孔中，其平均含量少于一個拷貝。數(shù)字PCR經(jīng)過計(jì)數(shù)從單個模板分子擴(kuò)增而來的NANA模板分子數(shù)相關(guān)。等221 三體細(xì)胞株中提取人類基因組NA，隨后2 21 12 號染色體上的磷酸甘油醛脫氫酶基因設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman 探針，適當(dāng)稀釋后的NA 40 個循環(huán)的兩步法PCR2 基因的比值為11，212 32。該法不具有其他分子技術(shù)的局限性，比定量PCR 的精確度更高，受擴(kuò)增效率波動的影響較小，不依賴于等位基因的分布，即使是嵌合體和母血污染的NA 都可以檢測到信號2，可用于檢測任何一種非整倍體疾病。小結(jié)綜上所述，各種鑒于PCR 的定性、半定量、定量技

17、術(shù)廣泛應(yīng)用于常見非整倍體疾STR-PCR 法、QF-PCR PCR QF- PCR 的應(yīng)用更為普遍。數(shù)字PCR 能夠提供更多的診斷信息，結(jié)果的可靠性將會更高，成本也更高一些，值得進(jìn)一步的應(yīng)用研究。參考文獻(xiàn)1臧春霞，李玉華，王仁禮.多重定量熒光PCR 在常見染色體非整倍體疾病快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究J.生殖與避孕，2004 ，6 ：333-337.2FanHC，QuakeSR.etectionof，79：7576-7579.3王希玲，蔣秀蓉，王仁禮.定量熒光PCR 在唐氏綜合征快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究J.生殖與避孕，2003 ，4 ：214-219.4Hochmeister MN.NA tech

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