微生物的保藏技術(shù)課件

1、微生物的保藏方法 微生物的保藏方法 主要內(nèi)容常用的保藏方法1保藏原理2注意事項(xiàng)3主要內(nèi)容常用的保藏方法1保藏原理2注意事項(xiàng)3菌種保藏的原因 通過(guò)分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過(guò)各種保藏技術(shù)使其在一定時(shí)間內(nèi)不死亡，不會(huì)被其他微生物污染，不會(huì)因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無(wú)法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進(jìn)行。 菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。菌種保藏的原因 通過(guò)分離純化得到的微生物純菌種保藏原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不

2、至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。菌種保藏原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 ATCC是美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 。ATCC的成立可追溯到1925年，一個(gè)科學(xué)委員會(huì)認(rèn)識(shí)到科學(xué)研究對(duì)于微生物的大量需求而萌發(fā)了創(chuàng)建一個(gè)微生物相關(guān)制品供應(yīng)中心的想法。ATCC以生命科學(xué)領(lǐng)域全方位知識(shí)的獲取，分類，匯總，完善進(jìn)而廣泛傳播為己任，以期為推動(dòng)生物原料，生物信息，生物技術(shù)，知識(shí)產(chǎn)權(quán)，規(guī)范等相關(guān)領(lǐng)域的前沿性、合法化、實(shí)用性發(fā)揮一定的作用。 ATCC擁有目前世界上最大的、品種最豐

3、富的微生物、細(xì)胞系以及重組DNA原料，同時(shí)它也是科研工作者公認(rèn)的提供世界級(jí)的可靠的研究材料的供應(yīng)商。 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 ATCC是美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC) ATCC 主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。 該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動(dòng)物1800株，

4、動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 美國(guó)典型微生物中國(guó)菌種保藏管理中心中國(guó)菌保會(huì)是國(guó)際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心： （1）普通微生物菌種保藏管理中心；（2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；（3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心； （4）醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心； （5）抗生素菌種保藏管理中心； （6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心； （7）林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。（1984 年增加） 中國(guó)菌種保藏管理中心中國(guó)菌保會(huì)是國(guó)際認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)，下設(shè)中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心

5、我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)和國(guó)際菌種保藏聯(lián)合會(huì)成員之一，隸屬于中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，專業(yè)從事工業(yè)微生物菌種資源保藏管理的公益基礎(chǔ)性資源保藏機(jī)構(gòu)，負(fù)責(zé)全國(guó)工業(yè)生產(chǎn)與研究應(yīng)用微生物菌種資源的收集、整理、鑒定、保藏、供應(yīng)與國(guó)際交流。 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫(kù)藏備份80000余支 。中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心Agricultural Culture Colle

6、ction of Chin（ACCC） ACCC是中國(guó)國(guó)家級(jí)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理專門機(jī)構(gòu),負(fù)責(zé)全國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種的收集、鑒定、評(píng)價(jià)、保藏、供應(yīng)及國(guó)際交流任務(wù). 庫(kù)藏菌種2490株,其中細(xì)菌1004株,放線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心成立（英文縮寫：CGMCC，設(shè)立在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所） 1985年，開(kāi)始用于專利程序的微生物保存 1995年，獲得布達(dá)佩斯條約國(guó)際保藏中心（IDA）的資格 1995年，加入中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì) 宗旨和任務(wù) 。

7、 作為一個(gè)非贏利性、公益性、服務(wù)性技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)，CGMCC的宗旨是廣泛收集國(guó)內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開(kāi)的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 中國(guó)微生物菌種保藏管德國(guó)與韓國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 德國(guó)微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細(xì)菌、2400種真菌、500種酵母菌、300種質(zhì)粒、500種動(dòng)物細(xì)胞、500種植物細(xì)胞、170種動(dòng)物雜腫瘤、600種植物病毒、90種細(xì)菌病毒等（德文，英文

8、）。 韓國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏（KACC），保藏有細(xì)菌890種、真菌1581種、酵母菌62種、cDNA 600種（英文）。 德國(guó)與韓國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 德國(guó)微生物菌物法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 法國(guó)國(guó)家歷史自然博物館Algotheque du實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National dHistoire Naturelle（ALCP） ALCP隸屬于法國(guó)國(guó)家歷史自然博物館，主要從事于工業(yè)微生物學(xué)，應(yīng)用微生物學(xué)，微生物系統(tǒng)分類學(xué)，培養(yǎng)和保藏方法等方面的研究，以及藻類等微生物的分離，鑒定，保藏工

9、作。保藏有藻類600種、細(xì)菌200種。該中心保藏的菌種可出售。 法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心 法國(guó)國(guó)家歷史自然博各國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心法國(guó)巴斯德研究所LInstitut Pasteur菌物保藏中心Collection de LInstitut Pasteur Of Institut Pasteur(CIP) 加拿大國(guó)家微生物健康實(shí)驗(yàn)室微生物菌種保藏中心National Microbiology Laboratory Health Canada Culture Collections（NML-HCCC）日本生物技術(shù)研究所微生物菌種保藏中心Marine Biotechnology Institute Cul

10、ture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC) 各國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物保藏中心法國(guó)巴斯德研究所LInstitut P微生物的保藏技術(shù)課件傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)保藏一、傳代培養(yǎng)保藏原理1優(yōu)缺點(diǎn)2注意事項(xiàng)3一、傳代培養(yǎng)保藏原理1優(yōu)缺點(diǎn)2注意事項(xiàng)3傳代培養(yǎng)的原理 有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì)很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。傳代培養(yǎng)的原理傳代培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn) 傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)

11、霉；菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；反復(fù)傳代時(shí)，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。傳代培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn) 傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便，但傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng) 傳代保存時(shí)，培養(yǎng)基的濃度不宜過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長(zhǎng)溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。 一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。 傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng) 傳代保存時(shí)，培養(yǎng)基的濃度

12、不二、冷凍保藏原理 適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無(wú)論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對(duì)菌體造成損傷，使其代謝作用停止，可達(dá)到保藏的目的。二、冷凍保藏原理 常用的冷凍保藏法液氮保藏法1低溫冰箱保存法2干冰保存法3常用的冷凍保藏法液氮保藏法1低溫冰箱保存法2干冰保存法3液氮保存法一、適用范圍 液氮溫度在-196以下,用于快速制冷,速凍,機(jī)械安裝等,一般不用于日常生活,此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏，而且性狀不變

13、異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。 二、保藏方法 a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.21ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。 b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（150170）時(shí)，則不需熔封。 液氮保存法一、適用范圍c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?30分鐘后，觀察有無(wú)色素進(jìn)入安瓶。d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1/min的速度冷卻至25左右，也可在2025的冰箱內(nèi)緩慢冷卻3060min。e、速冷：最后浸入液氮中快速冷

14、卻至196。 這種方法適用范圍廣，而且是目前常用的較理想的，繁而高效。保藏期23年，甚至長(zhǎng)達(dá)9年。c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)奈⑸锏谋２丶夹g(shù)課件低溫冰箱保存法一、適用范圍 20、50或85二、保藏方法 低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過(guò)多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用5mm的玻璃珠來(lái)吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。低溫冰箱保存法一、適用范圍干冰保存法一、適用范圍 70左右 二、保藏方法 將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。干冰保存法一、適用范圍菌種保藏的共同注意點(diǎn)

15、：1、嚴(yán)格的無(wú)菌操作；2、用于保存的微生物在生長(zhǎng)前必須處于它生長(zhǎng)良好的狀態(tài)；3、保藏過(guò)程中要防止退化的發(fā)生（不同的保藏方法，分別有不同的保存時(shí)間。） 菌種保藏的共同注意點(diǎn)：1、嚴(yán)格的無(wú)菌操作；注意事項(xiàng)要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞；要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長(zhǎng)；最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；可在菌液內(nèi)添加甘油（甘油管冷凍保藏法）等保護(hù)劑，以防止在冷凍過(guò)程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言

16、，不加保護(hù)劑時(shí)更有效。原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在20范圍內(nèi)以1/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對(duì)絕大多注意事項(xiàng)要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞； 數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲(chóng)則可在35范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍；若進(jìn)行長(zhǎng)期保存，則貯藏溫度越低越好；取用冷凍保存的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在3540溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來(lái)說(shuō)，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降?？傊紫缺３衷鷥?yōu)良性狀長(zhǎng)期穩(wěn)

17、定，同時(shí)考慮方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。 數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲(chóng)則可在3三、干燥保藏法1、沙土管保存2、冷凍真空保藏三、干燥保藏法1、沙土管保存沙土管保存1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如：芽孢桿菌、放線菌等。2、方法：將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長(zhǎng)出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無(wú)菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。沙土管保存1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如 沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽真空的干燥器中，然抽干后將真空干燥器的旋塞關(guān)閉即可。不用火焰封口，用時(shí)將真空

18、干燥器放氣打開(kāi)取出，剩余的繼續(xù)抽真空，抽至真空后關(guān)閉旋塞保藏即可。 此法簡(jiǎn)單易行，并可以將微生物保藏較長(zhǎng)時(shí)間，適合一般實(shí)驗(yàn)室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。 沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽冰凍真空保藏 原理是首先將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品先預(yù)冷，使其凍結(jié)，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。冰凍真空保藏 原理是首先將加有保護(hù)劑的細(xì) 達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命

19、活動(dòng)處于休眠，可以達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。 用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對(duì)較小，存活率及保藏效果均不錯(cuò)，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿瓶的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法。 達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉注意事項(xiàng) a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說(shuō)，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜；菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好；菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到1091010/ml。b、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封

20、入標(biāo)簽。c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0恒溫干燥。d、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。注意事項(xiàng) a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)總結(jié) 除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。 由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對(duì)不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒(méi)有一種方法被證明對(duì)所有的微生物適宜。 因此，在具體選擇保藏方法時(shí)必須對(duì)被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。對(duì)一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失?？偨Y(jié) 除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。9月-229月-22Sunday, September 25, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。