生物化學(xué)簡明教程第四版酶市公開課獲獎?wù)n件

1、第五章 酶(enzyme)第1頁第1頁酶發(fā)展歷史1837年，瑞典化學(xué)家Berzelius認為發(fā)酵是活細胞造成，首先想到催化作用。1857年P(guān)asteur認為酒發(fā)酵是酵母(yeast)細胞生命活動結(jié)果，細胞破裂則失去發(fā)酵作用。1878年Kuhne提出了enzyme，源于希臘語酵母中(in yeast)，中文：酵素 酶1897年Buchner弟兄用不含酵母細胞提取液完畢了發(fā)酵，證實酶無生命，只是一個化學(xué)物質(zhì)。Eduard Buchner是第一位提出酵素能夠獨立出細胞而產(chǎn)生作用，獲19諾貝爾化學(xué)獎。1926年Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，初次證實酶是蛋白質(zhì)。1930年Northrop得到胃蛋白酶

2、結(jié)晶。1946年Sumner和Northrop取得諾貝爾化學(xué)獎。1965年Blake對溶菌酶進行了X-射線衍射分析，酶活性中心催化機理取得了直接而詳細解釋。1982年Cech發(fā)覺個別RNA含有自我催化作用，提出Ribozyme概念。第2頁第2頁The Nobel Prize in Chemistry 1907for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation (1897)Eduard Buchner 第3頁第3頁The Nobel Prize in Chemistry 1946for his di

3、scovery that enzymes can be crystallized (1926)for their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form James Batcheller Sumner John Howard Northrop Wendell Meredith Stanley 第4頁第4頁The Nobel Prize in Chemistry 1972for his work on ribonuclease, especially concerning the connection between th

4、e amino acid sequence and the biologically active conformation for their contribution to the understanding of the connection between chemical structure and catalytic activity of the active centre of the ribonuclease molecule Christian B. Anfinsen Stanford Moore William H. Stein 第5頁第5頁The Nobel Prize

5、 in Chemistry 1989for their discovery of catalytic properties of RNA (1982)Sidney Altman Thomas R. Cech 第6頁第6頁酶是生物催化劑。 酶概念第7頁第7頁酶化學(xué)本質(zhì)絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)以后發(fā)覺有些核酸也含有催化活性如：L19RNA，核糖核酸酶Pribozyme ：核酶第8頁第8頁酶催化特性1、催化效率高；2、對環(huán)境原因敏感；3、酶活性含有調(diào)整性;4、專一性。第9頁第9頁酶催化效率：比化學(xué)催化劑高1071013倍，比非催化反應(yīng)高1081020倍。例 2H2O22H2O+O2 反 應(yīng)活化能非催化反應(yīng)7

6、5.24kJ/mol鈀催化反應(yīng)48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol第10頁第10頁N+3H2熔鐵催化劑300-600， 200-800Atm2NH3酶對環(huán)境原因敏感Legume Nodules第11頁第11頁酶作用專一性酶作用專一性結(jié)構(gòu)專一性絕對專一性基團專一性立體異構(gòu)專一性旋光異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性第12頁第12頁絕對專一性第13頁第13頁酯酶-葡萄糖苷酶基團專一性第14頁第14頁胰蛋白酶作用位點第15頁第15頁旋光異構(gòu)專一性第16頁第16頁（反丁烯二酸）幾何異構(gòu)專一性第17頁第17頁酶分類1.氧化還原酶:A+BH2AH2+B2 .轉(zhuǎn)移酶：AR+BA+BR3 .水解酶：A

7、B +H2OAOH+BH4 .裂解酶ABA+B5 .異構(gòu)酶6 .合成酶ABA+B+ATPAB+ADP+Pi第18頁第18頁六大類酶催化反應(yīng)性質(zhì) 1氧化還原酶類（oxido-reductases） （1）氧化酶類：催化底物脫氫，并氧化生成H2O或H2O2 。2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 鄰苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，鄰苯二酚：氧氧化酶） 鄰苯二酚鄰苯醌例：第19頁第19頁（2）脫氫酶類：直接催化底物脫氫 A2H + B A + B2H 例：乳酸丙酮酸乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化還原酶）第20頁第20頁2轉(zhuǎn)移酶類（transfe

8、rases） 催化基團轉(zhuǎn)移 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶）例：第21頁第21頁3水解酶類（hydrolases） AB + H2O AOH + BH 例：-葡萄糖苷酶第22頁第22頁4裂合酶類（lyases） 從底物移去一個基團而形成雙鍵或逆反應(yīng) AB A + B 例：第23頁第23頁5異構(gòu)酶類（isomerase） 催化異構(gòu)化反應(yīng) 例：第24頁第24頁6合成酶類（synthetases, 也稱ligases連接酶類） 將兩個小分子合成一個大分子，通常需要ATP供能。 例： 第25頁第25頁酶命名1習(xí)慣名稱（recommended name） （1

9、）底物 ： 如蛋白酶，脂肪酶（2）反應(yīng)性質(zhì)：如脫氫酶，裝轉(zhuǎn)氨酶 （3）底物和反應(yīng)性質(zhì)：如琥珀酸脫氫酶 （4）起源或其它特點：如胃蛋白酶 命名依據(jù)：第26頁第26頁1961年國際酶學(xué)委員會（enzyme commission）提出酶命名和分類辦法。2系統(tǒng)名稱（systematic name） （1）標明底物，催化反應(yīng)性質(zhì) （2）兩個底物參與反應(yīng)時應(yīng)同時列出，中間用冒號（:） 分開。如其中一個底物為水時，水可略去。 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶 第27頁第27頁酶編號: 用4個阿拉伯數(shù)字編號表示，數(shù)字中用“”隔開，前面冠以E

10、C（為Enzyme Commission）。EC 類.亞類.亞亞類.排號，如EC l.1.1.1 第28頁第28頁酶構(gòu)成 1單純酶類 2結(jié)合酶類 全酶=酶蛋白+輔因子輔因子金屬離子小分子有機化合物輔酶（coenzyme）輔基（prosthetic group）第29頁第29頁依據(jù)酶蛋白分子特點將酶分成三類 1單體酶（monomeric enzyme） 2寡聚酶（oligomeric enzyme） 3多酶復(fù)合物（multienzyme complex） 第30頁第30頁單體酶只有1條多肽鏈酶。第31頁第31頁寡聚酶由幾種亞基構(gòu)成酶，亞基之間以非共價鍵連接。第32頁第32頁多酶絡(luò)合物幾種酶嵌合而

11、成絡(luò)合物，這些酶功效相關(guān)，催化一系列連續(xù)反應(yīng)第33頁第33頁活性部位（活性中心）結(jié)合基團催化基團酶結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系酶活性中心（active center） (binding group)(catalytic group)第34頁第34頁Glu和Asp-COOH構(gòu)成酶活性中心氨基酸側(cè)鏈基團主要有Lys-NH2His咪唑基Ser-OHCys-SHTyr側(cè)鏈基團第35頁第35頁Active sites may include distant residues. (A) Ribbon diagram of the enzyme lysozyme with several components of th

12、e active site shown in color. (B) A schematic representation of the primary structure of lysozyme shows that the active site is composed of residues that come from different parts of the polypeptide chain.活性中心中基團，在一級結(jié)構(gòu)中也許相距較遠第36頁第36頁必需基團活性中心基團都是必需基團活性中心以外基團呢？第37頁第37頁底 物 活性中心以外必需基團結(jié)合基團催化基團 活性中心 第38頁第

13、38頁胰凝乳蛋白酶His57, Asp102, Ser195構(gòu)成活性中心Ile16, His57, Asp102, Asp194, Ser195是酶表現(xiàn)活性所必需第39頁第39頁Enzyme inhibition by diisopropylphosphofluoridate (DIPF), a group-specific reagent. DIPF can inhibit an enzyme by covalently modifying a crucial serine residueSer195必需基團被化學(xué)修飾后果：乙酰膽堿酯酶第40頁第40頁第41頁第41頁酶原激活胃蛋白酶原(pe

14、psinogen) 胰蛋白酶原(trypsinogen)胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)酶原(zymogen)：不具催化活性酶前體酶原激活：某種物質(zhì)作用于酶原使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢?性酶過程。第42頁第42頁胃蛋白酶原（pepsinogen）激活 使活性中心得以暴露出來第43頁第43頁賴纈天天天天甘異賴纈天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原激活第44頁第44頁3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）激活 Three-dimensional structure of chymotrypsin. The three chains

15、 are shown in ribbon form in orange, blue, and green. The side chains of the catalytic triad residues, including serine 195, are shown as ball-and-stick representations, as are two intrastrand and interstrand disulfide bonds.第45頁第45頁酶原激活意義？第46頁第46頁 同工酶(isoenzyme or isozyme) 同一個屬或同一個體不同組織或同一組織，同一細胞中存

16、在著含有不同分子形式但卻催化相同化學(xué)反應(yīng)酶，稱為同工酶。第47頁第47頁乳酸 丙酮酸 LDH5骨骼肌:乳酸 丙酮酸 心肌:LDH1乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）第48頁第48頁 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH） 1、構(gòu)成和電泳行為 HHHH (LDH1) HHHM (LDH2) HHMM (LDH3) HMMM (LDH4) MMMM (LDH5)第49頁第49頁不同分子形式同工酶催化相同化學(xué)反應(yīng)為何會這樣？ 由于它們活性部位在結(jié)構(gòu)上相同或極為相同。第50頁第50頁酶催化作用機理活化分子（處于過渡態(tài)分子）活化能第51頁第51

17、頁減少反應(yīng)所需活化能 E+SESEPP+E中間產(chǎn)物學(xué)說第52頁第52頁第53頁第53頁光譜吸取帶645583561548530498E+E+H2O2+E+H2O2+AH2+E：過氧化物酶中間絡(luò)合物證據(jù)H2O2 + AH2A + 2H2O過氧化物酶第54頁第54頁鎖鑰學(xué)說（lock and Key theory） 1894年 Fischer 提出誘導(dǎo)契合學(xué)說（induced-fit theory） 1958年 Koshland提出第55頁第55頁羧肽酶誘導(dǎo)契合模式 底物第56頁第56頁1、鄰近定向效應(yīng)；2、“張力”和“形變”；3、酸堿催化；4、共價催化;5、金屬離子催化。使酶具高催化效率原因第5

18、7頁第57頁兩個反應(yīng)分子，它們反應(yīng)基團互相靠近。鄰近效應(yīng)ABABABABAB第58頁第58頁指酶催化基團與底物反應(yīng)基團之間定向。 定向效應(yīng)第59頁第59頁第60頁第60頁張力效應(yīng)和底物形變（strain and distortion） 第61頁第61頁酸堿催化（acid-base catalysis） 第62頁第62頁共價催化（covalent catalysis） 共價催化 親電子催化 親核催化第63頁第63頁酶促反應(yīng)速度測定酶促反應(yīng)動力學(xué)測定反應(yīng)時間越長越好嗎？應(yīng)當測定反應(yīng)初速度研究影響酶促反應(yīng)速度原因即底物消耗量很?。ㄆ胀ㄔ?以內(nèi)）時反應(yīng)速度第64頁第64頁酶濃度與反應(yīng)速度關(guān)系vE當S足

19、夠大時，則v=kE第65頁第65頁底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系第66頁第66頁當?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。SVVmax第67頁第67頁伴隨底物濃度增高反應(yīng)速度不再成正百分比加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。SVVmax第68頁第68頁當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應(yīng)速度不再增長，達最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)SVVmax第69頁第69頁（米氏方程）第70頁第70頁k2k3k2k3=令：（米氏常數(shù)）k2k3k3Et = E + ESk3k3第71頁第71頁米氏常數(shù)意義當時：因此，米氏常數(shù)涵義是：當反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度二分之一時，底物濃度第72頁第72頁Km是酶一個特性性常數(shù)只與酶性質(zhì)相關(guān)，

20、與酶濃度無關(guān)第73頁第73頁當酶能催化幾個不同底物時，Km值一樣嗎？如己糖激酶：以葡萄糖為底物時，km=0.15mmol/L 以果糖為底物時， km=1.5mmol/L哪個是最適底物？第74頁第74頁Km除了與底物類別相關(guān)外，還與哪些原因相關(guān)？pH溫度但與酶濃度和底物濃度無關(guān)因此km值是酶一個特性性常數(shù)第75頁第75頁如何測定米氏常數(shù)？（1）v對S作圖 第76頁第76頁雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk作圖法） 米氏方程轉(zhuǎn)換 第77頁第77頁pH對酶作用影響第78頁第78頁pH影響反應(yīng)速度原因 ( 1 ) pH影響了酶分子、底物分子和ES復(fù)合物 解離狀態(tài)。 ( 2 ) 過高、過低pH

21、造成酶蛋白變性。第79頁第79頁由于它除了受到底物種類、溫度、時間等影響外、還受底物濃度、酶濃度等原因影響。例: 堿性磷酸酶催化磷酸苯酯水解時 s為2.5x10-5 M，最適pH為 8.3 s為2.5x10-2 M，最適pH為10.0 酶最適pH不是一個固定常數(shù)第80頁第80頁溫度對酶反應(yīng)速度影響 第81頁第81頁它隨底物種類、濃度, 溶液離子強度, pH, 反應(yīng)時間等影響。最適溫度與最適pH同樣，也不是一個固定常數(shù)第82頁第82頁激活劑（activator）對酶反應(yīng)速度影響 酶激活劑：能提升酶活力物質(zhì)1. 無機離子 金屬離子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+

22、等。 陰離子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等 2. 有機小分子: 如Cys、GSH等3. 含有蛋白質(zhì)性質(zhì)大分子，如一些蛋白激活。第83頁第83頁克制劑(inhibitor)影響 克制作用（inhibition） ：使酶必需基團化學(xué)性質(zhì)改變而減少酶活力甚至使酶完全喪失去活性物質(zhì)第84頁第84頁1、不可逆克制作用(irreversible inhibition) 2、可逆克制作用(reversible inhibition)（2）非競爭性克制作用(noncompetitive inhibition)（1）競爭性克制作用(competitive inhibition)第85頁第85頁1、不可逆克

23、制作用（irreversible inhibition） E + I EI例: DFP（DIFP）對胰凝乳蛋白酶克制 克制劑與酶分子上一些基團共價結(jié)合第86頁第86頁2、可逆克制作用(reversible inhibition)（1）競爭性克制作用（competitive inhibition） E+I EI 第87頁第87頁例: 丙二酸對琥珀酸脫氫酶克制作用 克制劑結(jié)構(gòu)與某種底物結(jié)構(gòu)類似第88頁第88頁競爭性克制作用動力學(xué)方程EI+S no reaction 推導(dǎo)出方程 第89頁第89頁競爭性克制作用動力學(xué)方程特性 當 I 0時，方程還原成米氏方程。 當 I 時， 1/2Vmax第90頁第9

24、0頁競爭性克制應(yīng)用H2NCOO-H2NSO2NH2對-氨基苯甲酸對-氨基苯磺酰胺第91頁第91頁（2）非競爭性克制作用（noncompetitive inhibition） E+S ES ESI E+I EI ESI 第92頁第92頁非競爭性克制作用動力學(xué)方程第93頁第93頁非競爭性克制作用動力學(xué)方程特性當I0 I 第94頁第94頁酶別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)酶(allosteric enzyme)特點：有多亞基有兩個中心：活性中心和別構(gòu)中心活性中心別構(gòu)中心別構(gòu)中心活性中心含有別構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)第95頁第95頁別構(gòu)調(diào)整物(allosteric effector)能與別構(gòu)酶結(jié)合并能

25、調(diào)整其活性物質(zhì) 別構(gòu)調(diào)整物類型底物或底物類似物小分子代謝產(chǎn)物別構(gòu)激活劑（正效應(yīng)物）別構(gòu)克制劑（負效應(yīng)物）第96頁第96頁協(xié)同效應(yīng)(cooperative effect)正協(xié)同效應(yīng)負協(xié)同效應(yīng)一個效應(yīng)物分子與別構(gòu)酶別構(gòu)中心結(jié)合后，對第二個效應(yīng)物分子結(jié)合所產(chǎn)生影響。第97頁第97頁別構(gòu)酶舉例 大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase, ATCase） 第98頁第98頁 ATCase催化化學(xué)反應(yīng)CO2+Glu+ATP第99頁第99頁 ATCase活性調(diào)整機理 有催化活性構(gòu)象 無催化活性構(gòu)象 第100頁第100頁+ATP+CTP 別構(gòu)酶形曲線S V

26、1/2Vmax-第101頁第101頁酶活力測定注意事項：1、測定反應(yīng)初速度2、在一套固定條件下進行測定辦法第102頁第102頁酶活力（enzyme activity） 在一定條件下，分鐘能轉(zhuǎn)化mol底物酶量稱為一個酶單位(U)。 第103頁第103頁酶比活力（specific activity，也稱比活性） 指每mg蛋白質(zhì)所含有酶活力，普通用 U/mg蛋白質(zhì)來表示，能夠用比活力來表示酶純度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） 比活力有時也可用每g或每ml酶含多少個活力單位來表示。 第104頁第104頁酶制備提取純化保留思考題：從肝細胞中提取一個蛋白水解酶粗提液300ml含

27、有150mg蛋白質(zhì)，總活力為360單位。通過一系列純化環(huán)節(jié)以后得到4ml酶制品(含有0.08mg蛋白)，總活力為288單位，整個純化過程收率是多少？ 純化了多少倍？第105頁第105頁酶應(yīng)用（臨床方面）消化類：胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶酶等抗炎凈創(chuàng)類：胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等血凝和解凝類：凝血酶促使血液凝固，預(yù)防微血管出血。纖維蛋白溶解酶作用是溶解血塊，治療血栓靜脈 炎、冠狀動脈栓塞等解毒類：如青霉素酶能夠分解青霉素分子中一內(nèi)酰胺環(huán)，使變 成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起過敏反應(yīng)。第106頁第106頁Allosteric inhibitorsbin

28、d specificallyto the T state andmake it harder forsubstrate to switchenzyme into theR state.Allosteric activatorsbind specifically to theR state and pull moreof the enzyme into themore active R state.ALLOSTERIC EFFECTORS bind specifically to either the T or the R states.Heterotropic (nonsubstrate) activators bind to and stabilize the R state, while heterotropic inhibitors bind preferentially to the T state.第107頁第107頁TTRTRR+S+STTRRRT+S+S序變模型(simple sequential model)齊變模型(concerted model)第108頁第108頁Simple sequential model f