醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件

1、ORC：Origin Recognition Complex5、真核生物復(fù)制的起始“Licensing mechanisms”S期 DNA合成MCM：微染色體支持蛋白ORC：Origin Recognition Complex二 DNA鏈的延長(zhǎng)（一） 原核生物DNA鏈的延伸延伸反應(yīng)：在RNA引物的OH端由DNA聚合酶III，按堿基互補(bǔ)規(guī)則延伸。前導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)： 35方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成可以隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)，連續(xù)合成（5 3）。 二 DNA鏈的延長(zhǎng)（一） 原核生物DNA鏈的延伸隨從鏈的延長(zhǎng)5 3 方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)合成，只能分段合成一小段，這一小

2、段新合成的DNA鏈稱岡奇片段。每一段新合成的一小段中有RNA，由RNA酶水解，DNA聚合酶I補(bǔ)平，最后由連接酶連接。隨從鏈的延長(zhǎng)5 3 方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1) DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只能在3-OH羥基端延長(zhǎng)。復(fù)制起始時(shí)的3-OH羥基端是RNA。2) 按照堿基互補(bǔ)原則合成新鏈。3) 兩條鏈同時(shí)復(fù)制，新鏈的延伸方向是53，一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，另一條鏈不連續(xù)合成，稱隨從鏈（后隨鏈）。DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1) DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只4) 復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Replication fork）,

3、 復(fù)制叉從起始點(diǎn)沿著DNA移動(dòng)。4) 復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Rep醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸 Pol 合成一段新鏈 在RFC和PCNA協(xié)助下， Pol Pol 轉(zhuǎn)換 由Pol 完成全部前導(dǎo)鏈的合成2、后隨鏈的延伸（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件復(fù)制的基本模式型：細(xì)菌復(fù)制的基本模式型：細(xì)菌滾環(huán)式 X174D型 線粒體DNA滾環(huán)式 X174A protein: Phage 編碼滾環(huán)可形成多聯(lián)體A protein: Phage 編碼線粒體DNA復(fù)制裸露閉環(huán)雙鏈狀 D型復(fù)制H鏈：富含GL鏈：富含

4、CDNA聚合酶線粒體DNA復(fù)制裸露閉環(huán)雙鏈狀 三 復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù)制到分子末端終止。對(duì)于環(huán)狀的大腸桿菌DNA復(fù)制和真核生物的DNA復(fù)制就比較復(fù)雜。 復(fù)制叉到達(dá)終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個(gè)子代DNA纏繞在一起，需要分開(kāi)。大腸桿菌： 有復(fù)制起始點(diǎn)，也有復(fù)制終止點(diǎn)。三 復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù) 細(xì)菌復(fù)制終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(terminator)位點(diǎn)，E. coli 有7個(gè)終止子位點(diǎn)。 Tus: Terminus utilization substance 細(xì)菌復(fù)制終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(t醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核

5、生物復(fù)制課件醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件 線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短，需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。53355335端粒DNA： 線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物R2009 諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)2009 諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)端粒和端粒酶發(fā)現(xiàn)大事記1939年，Barbara McClintock發(fā)現(xiàn)玉米細(xì)胞的染色體斷裂末端容易融合1972年，James Watson提出染色體復(fù)制的末端隱縮問(wèn)題1978年，報(bào)道四膜蟲(chóng)的端粒序列1982年，端粒的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致人工染色體的發(fā)明1984年，報(bào)道酵母的端粒序列1985年，報(bào)道四膜蟲(chóng)的端粒酶

6、活性1989年，報(bào)道四膜蟲(chóng)端粒酶的RNA亞基1994年，報(bào)道酵母端粒酶的RNA亞基1995年，報(bào)道酵母端粒酶活性1996年，純化了四膜蟲(chóng)端粒酶的催化亞基,遺傳篩選到酵母端粒酶的催化亞基1997年，證明了四膜蟲(chóng)和酵母端粒酶的催化亞基端粒和端粒酶發(fā)現(xiàn)大事記端粒酶(telomerase) 依賴RNA的DNA聚合酶,其實(shí)質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。 能識(shí)別特定的端粒重復(fù)序列,以自身RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC- 3)為模板,合成新的端粒重復(fù)序列,使端粒延長(zhǎng)，保持染色體的完整 不需要DNA 模板 已知的惡性腫瘤特異性最強(qiáng)的標(biāo)志，永生細(xì)胞 生殖細(xì)胞，造血干細(xì)胞，ips等非腫瘤細(xì)胞 端粒的縮短與衰老端

7、粒酶(telomerase)端粒酶以自身的RNA為模板，在3端合成DNA序列:RNA引物端粒酶以自身的RNA為模板，RNA引物端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件母鏈藉非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)回折DNA聚合酶端粒合成完成進(jìn)一步加工母鏈藉非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)回折DNA聚合酶端粒合成完成進(jìn)一步加工逆向轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription)上世紀(jì)之初發(fā)現(xiàn)腫瘤RNA病毒。64年，Temin報(bào)道了抑制DNA合成的放線菌素D能抑制雞肉瘤RNA病毒的繁殖。據(jù)此提出雞肉瘤RNA病毒的繁殖須經(jīng)過(guò)形成DNA的階段。逆向轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription)上70年Temin 和B

8、altimore 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒顆粒中存在著一種以RNA為模板合成DNA的酶，稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。遺傳信息從RNA流向DNA，即以RNA為模板合成DNA稱為逆向轉(zhuǎn)錄，因此催化這一反應(yīng)的酶又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。70年Temin 和Baltimore 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)從(雞逆向轉(zhuǎn)錄酶由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中pol基因編碼。是一種多功能酶。有以RNA為模板和以DNA為模板合成DNA的DNA聚合酶活性。需要RNA或DNA做引物；有核糖核酸酶H的活性（在逆轉(zhuǎn)錄酶的C端），能從35和從53水解RNA，使RNA與DNA的雜交體分離。逆

9、向轉(zhuǎn)錄酶由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中pol基因編碼。是一種多功能逆向轉(zhuǎn)錄過(guò)程逆向轉(zhuǎn)錄過(guò)程 三 逆向轉(zhuǎn)錄酶的生物學(xué)意義1 用于合成cDNA. 建立cDNA文庫(kù)(cDNA Library)，獲得基因或探針。2 與PCR連用 RT-PCR互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA） 三 逆向轉(zhuǎn)錄酶的生物學(xué)意義互補(bǔ)DNA（compleme 第四節(jié) DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的一個(gè)關(guān)鍵事件，因此，DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。無(wú)論原核還是真核細(xì)胞中DNA復(fù)制都只發(fā)生在細(xì)胞周期中特定時(shí)期，在一個(gè)細(xì)胞周期中，DNA必須也只能復(fù)制一次。 第四節(jié) DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞

10、增殖的一個(gè)關(guān)一 大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1、起始體 （ orisome，起始復(fù)合物，蛋白質(zhì)-ori C復(fù)合物）的裝配 參與形成orisome的組分：Dna A, Hu, IHF，F(xiàn)is，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A相互作用 ：Fis, IHF 調(diào)節(jié) DnaA-ATP與oriC 的結(jié)合，HU調(diào)節(jié)DnaA, IHF 結(jié)合到oriC, 并增強(qiáng)DnaA解鏈能力。一 大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1、起始體 （ orisome，起2、防止復(fù)制再次起始(1) Dna A活性的抑制 Dna A-ADP Dna A-ATP無(wú)活性 RIDA 有活性 RIDA：regulatory ina

11、ctivation of DnaA 2、防止復(fù)制再次起始RIDA：regulatory inacori C(2) 降低游離形式的Dna A水平Dna A結(jié)合位點(diǎn) dat A區(qū)在復(fù)制后極短時(shí)間內(nèi)降低 Dna A 水平可以結(jié)合300分子的Dna Aori C(2) 降低游離形式的Dna A水平Dna A結(jié)合(3)隔離 ori C ori CGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈Seq A 特異識(shí)別,并結(jié)合于半甲基化ori C 的GATC序列,使ori C被隔離,防止復(fù)制再次發(fā)生ori CGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈Seq二 真核生物復(fù)制起始調(diào)控1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控2、細(xì)胞

12、周期監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制主要調(diào)控復(fù)制的起始二 真核生物復(fù)制起始調(diào)控1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控主要調(diào)控復(fù)制(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇 復(fù)制起始點(diǎn)數(shù)量的調(diào)控 真核細(xì)胞有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，起用多少起始點(diǎn)決定于S期的長(zhǎng)短。 S期短，起始點(diǎn)多。S期長(zhǎng)，起始點(diǎn)少。 遺傳性起始點(diǎn)： DNA上的起始元件 功能性起始點(diǎn)： 實(shí)際起始點(diǎn) 遺傳性起始點(diǎn)多于功能性起始點(diǎn)(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇酵母：自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequeences, ARS)酵母細(xì)胞3號(hào)染色體上有14個(gè)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)，只有6個(gè)功能性復(fù)制起始點(diǎn)。將Ura4基因處的強(qiáng)復(fù)制

13、起始點(diǎn)突變后，在其附近的弱復(fù)制起始點(diǎn)就成為強(qiáng)復(fù)制起始點(diǎn)。 Ura4：乳清苷酸脫羧酶 酵母：自主復(fù)制序列（autonomously replica高等真核生物細(xì)胞至今未發(fā)現(xiàn)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)的序列特征，但確實(shí)存在功能性的復(fù)制起始點(diǎn)。CHO細(xì)胞核 蟾蜍卵細(xì)胞抽提物 損壞CHO細(xì)胞核或 裸露DNA 非隨機(jī)起始，同正常 隨機(jī)起始CHO細(xì)胞 復(fù)制起始點(diǎn)的選擇與細(xì)胞核或染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)高等真核生物細(xì)胞至今未發(fā)現(xiàn)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)的序列特征，但確實(shí)2、 復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Licensing model） （2）蛋白激酶的調(diào)控2、 復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Licensin （1

14、） 復(fù)制的允許機(jī)制（Licensing model） 一個(gè)細(xì)胞周期中DNA復(fù)制發(fā)生一次且只能發(fā)生一次 蟾蜍卵細(xì)胞 Licensing control 復(fù)制外源細(xì)胞核 （1） 復(fù)制的允許機(jī)制（Licensing model）醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件復(fù)制后，Licensing Factor失活，失活的Licensing Factor不能再次啟動(dòng)復(fù)制。核膜破裂后（細(xì)胞分裂后），新的Licensing Factor進(jìn)入核，啟動(dòng)下一周期的DNA復(fù)制。復(fù)制后，Licensing Factor失活，失活的（2） 蛋白激酶的調(diào)控真核細(xì)胞復(fù)制起始絕對(duì)必須的蛋白激酶： CDK 和 Cdc7-Dbf4激酶(1

15、)、前復(fù)制起始復(fù)合物的形成 組成成分：ORC(Origin Recognition Complex) 含6種蛋白質(zhì)，Cdc6，RLF （Replication Licensing Factor, 復(fù)制允許因子）。(2)、CDK激活前復(fù)制起始復(fù)合物 復(fù)制前復(fù)合物受蛋白激酶的調(diào)控，或變成起始復(fù)合物，起始復(fù)制，或在復(fù)制過(guò)程中轉(zhuǎn)變成復(fù)制后復(fù)合物，就再也不能啟動(dòng)復(fù)制。 CDK（CyclinDependent), Cdc7-Dbf4激酶， 蛋白激酶A，蛋白磷酸酶2A，都參與復(fù)制的起始，在不同階段起作用。（2） 蛋白激酶的調(diào)控真核細(xì)胞復(fù)制起始絕對(duì)必須的蛋白激酶：前復(fù)制起始復(fù)合物（pre-replicativ

16、e complex，pre-RC) （在遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)裝配） CDK起始復(fù)合物（Replicative Complex,RC) （在功能性復(fù)制起始點(diǎn)形成）在G1期向S期過(guò)渡期間，CDK活性很高。醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件CDK同時(shí)又是防止在同一細(xì)胞周期中DNA復(fù)制再次發(fā)生的因素,阻止復(fù)制起始復(fù)合物的組裝。CDK對(duì)某些起始因子磷酸化,調(diào)控其在細(xì)胞內(nèi)水平。CDK同時(shí)又是防止在同一細(xì)胞周期中DNA復(fù)制再次發(fā)生的因素,（二） 復(fù)制檢查點(diǎn)機(jī)制 識(shí)別DNA損傷或DNA復(fù)制阻斷，通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻斷細(xì)胞周期，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，恢復(fù)基因組的完整性，修復(fù)后再進(jìn)入細(xì)胞周期。（二） 復(fù)制檢查點(diǎn)機(jī)制在長(zhǎng)期進(jìn)

17、化過(guò)程中，細(xì)胞形成一套保證細(xì)胞周期中DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制，即細(xì)胞周期檢查點(diǎn)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞形成一套保證細(xì)胞周期中DNA復(fù)制和染色檢查點(diǎn)：(1) G1 S期檢查點(diǎn)查看DNA有無(wú)損傷 DNA damage checkpoint 細(xì)胞周期暫時(shí)減慢或停止。查看DNA復(fù)制的進(jìn)度 DNA replication checkpoint 限制DNA復(fù)制速度(2) G2 M 管理染色體的正確分配 Spindle assembly checkpoint檢查點(diǎn)：(1) G1 S期檢查點(diǎn)第五節(jié) DNA損傷與修復(fù)DNA 損傷類型和產(chǎn)生原因點(diǎn)突變 DNA聚合酶復(fù)制錯(cuò)誤產(chǎn)生第五節(jié) DNA損傷與修復(fù)DN

18、A 損傷類型和產(chǎn)生原因堿基自發(fā)的突變：甲基化分析堿基自發(fā)的突變：甲基化分析缺失或插入 核苷酸的缺失或插入 堿基的缺失缺失或插入 化學(xué)修飾 氧化，甲基化，烷化化學(xué)修飾DNA分子交聯(lián) 順鉑，絲裂酶素DNA分子交聯(lián)DNA分子斷裂DNA單鏈斷裂DNA雙鏈斷裂：射線，重金屬， 病毒整合，DNA重排DNA分子斷裂醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件DNA損傷的修復(fù)核苷酸修復(fù) dGTP氧化產(chǎn)生8氧代dGTP 8oxodG 8氧代dGTP三磷酸脂酶 水解 該酶突變：A：TC：G突變高10010000倍DNA損傷的修復(fù)核苷酸修復(fù)dGTPdGTP直接修復(fù)O6甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT） 直接修復(fù)光修復(fù)光修復(fù)3

19、. 堿基切除修復(fù)DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶 3. 堿基切除修復(fù)DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶 4. 核苷酸切除修復(fù)4. 核苷酸切除修復(fù)5. 錯(cuò)配修復(fù)5. 錯(cuò)配修復(fù)醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件DNA鏈斷裂的修復(fù)非同源末端連接 non-homologous end-joiningDNA鏈斷裂的修復(fù)同源重組修復(fù) homologous recombination同源重組修復(fù) homologous recombinatio7. 大腸桿菌SOS修復(fù)Lex A， Rec A修復(fù)完成后，DinI蛋白抑制RecA作用 7. 大腸桿菌SOS修復(fù)Lex A， Rec A修復(fù)完成后醫(yī)用分子遺傳學(xué)真核生物復(fù)制課件Yeast two hybr

20、idYeast two hybridDNA損傷修復(fù)的調(diào)控機(jī)制DNA損傷修復(fù)的調(diào)控機(jī)制（1）G1期checkpoint，確保DNA損傷不被復(fù)制。這一階段，DNA損傷激活蛋白激酶ATM，ATR和cABL，導(dǎo)致P53的磷酸化，并進(jìn)一步上調(diào)P21 WAF1表達(dá)水平。P21可以結(jié)合cyclin-CDK從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。同時(shí)DNA損傷誘導(dǎo)Cdc25A的泛素化和降解，從而阻止細(xì)胞周期進(jìn)行；（2）S期checkpoint，主要是當(dāng)DNA損傷在G1期沒(méi)有能夠進(jìn)行修復(fù)時(shí)防止DNA復(fù)制；（3）G2期checkpoint，主要功能是當(dāng)細(xì)胞在S期晚期或者G2期DNA受到損傷時(shí)，阻止細(xì)胞分離，從而防止DNA損傷傳遞到子代

21、細(xì)胞中；（4）M期checkpoint，細(xì)胞在M期染色質(zhì)將發(fā)生固縮形成紡錘體結(jié)構(gòu)，在后期姐妹染色體發(fā)生分離。當(dāng)染色體受到損傷時(shí)，細(xì)胞停滯在M期，染色體重新恢復(fù)到染色質(zhì)，從而使細(xì)胞有機(jī)會(huì)對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)后再進(jìn)入M期。 （1）G1期checkpoint，確保DNA損傷不被復(fù)制。這DNA損傷與細(xì)胞凋亡DNA損傷ATM/ATR絲/蘇氨酸激酶CHK1，CHK2，P53等抗凋亡基因 凋亡相關(guān)基因線粒體膜通透性升高，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase細(xì)胞凋亡DNA損傷與細(xì)胞凋亡DNA損傷ATM/ATR絲/蘇氨酸激酶C外源性因素：UV，射線，化學(xué)試劑等內(nèi)源性因素：線粒體呼吸鏈產(chǎn)生活性氧 reactive oxygen species（ROS），NO 50000個(gè)損傷/天細(xì)胞DNA損傷修復(fù)與疾病外源性因素：UV，射線，化學(xué)試劑等DNA損傷修復(fù)與疾病細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制小分子如谷胱甘肽清除自由基超氧化物歧化酶（SOD）：清除羥基自由基等 缺失導(dǎo)致腫瘤發(fā)生細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制小分子如谷胱甘肽清除自由基遺傳基因的突變，造成出生缺陷腫瘤影響細(xì)胞代謝，衰老DNA損傷修復(fù)缺陷：胚胎致死或嚴(yán)重疾病遺傳基因的突變，造成出生缺陷一些免疫抑制劑如環(huán)孢霉素A（cyclosporin A）、硫唑嘌呤（azathiopri