腦寧康顆粒對(duì)腦缺血預(yù)適應(yīng)大鼠HSP70表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、腦寧康顆粒對(duì)腦缺血預(yù)適應(yīng)大鼠HSP70表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的觀察中藥腦寧康(NNK)顆粒對(duì)經(jīng)腦缺血預(yù)適應(yīng)(IP)處理后大鼠HSP70表達(dá)的影響。方法根據(jù)Pulsinelli四管法及Liu法分別制作大鼠IP及腦缺血再灌注(IR)模型，應(yīng)用免疫組化SP法作HSP70染色，比擬NNK顆粒對(duì)IP和IR兩種模型大鼠HSP70表達(dá)的影響，并以阿斯匹林作對(duì)照。結(jié)果NNK在兩模型中均可使HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.050.01),且效應(yīng)顯著高于阿斯匹林(P0.05)，但兩模型之間比擬無顯著性差異。且NNK可以延緩HSP70表達(dá)強(qiáng)度的減弱。結(jié)論NNK顆粒通過增強(qiáng)IP和缺血狀態(tài)中HSP70表達(dá)，扮演了強(qiáng)

2、化IP及藥物預(yù)適應(yīng)角色，旨在增加腦神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧的耐受力，并通過對(duì)HSP70的干擾，獲得穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)造，維護(hù)其正常功能的藥理效應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】腦寧康顆粒；缺血預(yù)適應(yīng)；腦；HSP70Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetfNaningkangpartilentheexpressinfthe70KDaheatshkprtEin(HSP70)fllingtheratsisheiprenditin.ethdsTheratsIPandisheireperfusin(IR)delsereadebyethdsfPulsinellifurtubesandLiurespet

3、ively.TheexpressinfHSP70intratdelsinludingIPandIRereparedbyNNKpartileapplyingSPiunhistheistryethd.ResultsNNKpartileuldinreasetheHSP70expressinfIPandinthestatefisheiaandplaytherlenstrngingisheiprenditinfIPandediine.TheeffetfNNKpartilesuggestsinreasingthetleranefentralnerveellsfaingtisheiaandhypxia.nl

4、usinNNKpartilealsanstabilizethestruturefneurnthrughinterfereithHSP70expressin,andthenitdenstratethepharalgieffetfkeepingtheneurnnralfuntins.Keyrds：NNKpartile;Isheiprenditining;Brain;HSP70近年來，腦缺血預(yù)適應(yīng)(isheiprenditining,IP)過程中產(chǎn)生的機(jī)體重要保護(hù)因子熱休克蛋白Heatshkprtein,HSP已引起廣泛關(guān)注。對(duì)整體和離體經(jīng)應(yīng)激作用后的細(xì)胞或組織的研究說明1，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，均伴隨

5、HSP含量增加。因此，普遍認(rèn)為HSP的功能主要是在于穩(wěn)定細(xì)胞的構(gòu)造，從而維護(hù)細(xì)胞的正常生理功能。在腦缺血損傷領(lǐng)域的研究顯示，HSP具有保護(hù)腦細(xì)胞，增加腦細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性，明顯降低神經(jīng)元對(duì)谷氨酸毒性作用的敏感性2，從而抵抗神經(jīng)元進(jìn)一步致死性損傷的作用。本研究擬觀察HSP70在IP和腦缺血再灌注(isheireperfusin,IR)中的表達(dá)及腦寧康(NNK)對(duì)其的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與儀器1.1儀器多功能顯微鏡(LYPUS-269865,JAPAN)，電鏡JE-1200EX,JAPAN，醫(yī)用低溫冷凍冰箱SANY,JAPAN，電子蠕動(dòng)泵LDB-。1.2試劑與藥品鼠抗HSP70單克隆抗體Nea

6、rkerrpratin,USA，鏈卵白素生物素結(jié)合辣根過氧化酶，1300zyed,USA)，染色試劑盒Labvisinrpratin,USA。NNK顆粒由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬制劑廠消費(fèi)，生藥含量為5g/g；腸溶阿斯匹林(ASP)為沈陽克達(dá)藥廠消費(fèi)，批號(hào)970208。1.3動(dòng)物雄性istar大鼠48只，平均體質(zhì)量(30030)g，由山東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2方法2.1模型制備與取材2.2分組istar鼠48只，用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組(DEL)、假手術(shù)組(F)、ASP組和NNK組,每組均按IP方法和IR方法制模,共8組,每組6只。2.3模型制備2.3.1IP模型制備IP模型根據(jù)Pu

7、lsinelli四管法及Liu法3制備。戊巴比妥鈉50g/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，頸部正中線縱行切口，別離暴露第1頸椎，尋找雙側(cè)翼小孔，電灼封閉雙側(cè)椎動(dòng)脈。翻轉(zhuǎn)體位，頸部縱行切口，別離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈約2，4號(hào)手術(shù)線牽引。頭部正中切口，頂部鉆孔，埋藏微電極，齒科水泥固定。動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血，微電極連接八道生理儀觀察腦電圖,驗(yàn)證缺血效應(yīng)。缺血3in后,松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)供血，縫合皮膚，按成人劑量7倍分別給予NNK組及ASP組相應(yīng)藥物。24h后，再次夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈3in。假手術(shù)組依上法操作,但不封閉及夾閉椎動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈。各組飼以標(biāo)準(zhǔn)合成飼料,自然飲水。2.3.2IR模型制備IR模型

8、制備方法同上，但不進(jìn)展兩次3in缺血預(yù)適應(yīng)處理，服藥時(shí)間與IP模型同步。在IP模型第2次短暫缺血后72h，除假手術(shù)組外的其余6組均再次夾閉頸總動(dòng)脈10in，并于缺血再灌注24h后取血備測(cè)。2.3.3取材分別于IR后24，72h，戊巴比妥鈉50g/kg麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管后，通過LDG-型電子蠕動(dòng)泵，快速灌入肝素化生理鹽水2萬u/100l100l，隨后用4多聚甲醛磷酸緩沖液4，pH7.4，200l，灌注1h，立即冰臺(tái)取腦，別離皮層組織塊，動(dòng)存于-70冰箱，用于檢測(cè)HSP70表達(dá)。另一局部組織塊用0.1的磷酸緩沖液配制的1餓酸溶液pH7.4固定2h，PBS充分洗滌，1餓酸溶液后固

9、定，4，遞增濃度的酒精脫水，EPN812包埋液浸透，包埋。切片用醋酸鈉和枸櫞酸鉛染色，半薄切片定位，超薄切片，TE-1200EX透射電鏡觀察。2.4HSP70檢測(cè)方法根據(jù)匡式法，組織標(biāo)本冰凍切片上行30連續(xù)冠狀切片。室溫下，2TritinX-100液中孵育40in，切片浸入鼠抗HSP70單克隆抗體孵育48h，4?？贵w用1血清白蛋白磷酸緩沖液配制，經(jīng)PBS洗滌10in,浸入生物素結(jié)合兔抗鼠IgG，室溫下孵育2h，再經(jīng)PBS洗滌，切片浸入鏈卵白素-生物素結(jié)合辣根過氧化酶孵育2h(室溫)。PBS充分洗滌，加12滴DAB色素于2H126梯度脫水，透明，D-P-X封片備測(cè)。2.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12

10、.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，顯著性檢驗(yàn)用配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析，P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。3結(jié)果NNK對(duì)HSP70表達(dá)的影響見表1。由表1可見：皮層構(gòu)造中，再灌注24h、假手術(shù)組未見明顯HSP70陽性信號(hào)；IP模型組及再灌注模型組均可見HSP70陽性信號(hào)，但前者陽性細(xì)胞數(shù)量及染色深度明顯強(qiáng)于后者P0.05，提示經(jīng)IP處理后，HSP70表達(dá)明顯增加。以NNK及阿斯匹林干擾后發(fā)現(xiàn)，NNK在兩模型組中均可使HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng)P0.050.01，且效應(yīng)顯著高于阿斯匹林P0.05，提示NNK能積極干擾HSP70誘導(dǎo)程序。模型間比擬，NNK對(duì)HSP70的影響雖以IP模型稍強(qiáng)，但無明顯差異P0.

11、05。提示NNK既可能在IP過程中有誘導(dǎo)HSP70表達(dá)效應(yīng)，亦可能在缺血再灌注損傷中扮演藥物預(yù)適應(yīng)角色。從不同時(shí)期HSP70表達(dá)強(qiáng)度分析中發(fā)現(xiàn)與24h時(shí)相比擬，72h時(shí)相其表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱P0.05，但NNK可以延緩這一過程P0.05。提示NNK顆粒在誘導(dǎo)和調(diào)控HSP70表達(dá)方面均有藥理效應(yīng)。表1NNK顆粒對(duì)模型HSP70表達(dá)的影響4討論熱休克現(xiàn)象是Ritssa在觀察果蠅幼蟲唾液腺細(xì)胞染色體在過熱過程中形態(tài)變化時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的。后來，Tissieres等發(fā)現(xiàn)，染色體的膨突與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成有關(guān)，故稱其為熱休克蛋白HeatShkprtEin,HSP。生物體受外界環(huán)境的應(yīng)激作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP組分較

12、為復(fù)雜，不僅能產(chǎn)生分子量相差很大的HSP，也能產(chǎn)生幾個(gè)在分子量上非常接近的HSP。哺乳動(dòng)物以HSP70家族為主。熱應(yīng)激、缺血/缺氧、氧自由基等均是重要的誘導(dǎo)因素。近年來，HSP在缺血預(yù)適應(yīng)IP過程中的腦保護(hù)作用已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，之前大多認(rèn)為其保護(hù)大腦的機(jī)制是由于HSP70的伴侶作用。而最新報(bào)道認(rèn)為，HSP70也可以調(diào)節(jié)炎癥反響，從而顯示出其腦保護(hù)的作用。本研究結(jié)果說明，分別經(jīng)IP處理及缺血6in再灌注24h后，兩模型組istar鼠大腦皮層構(gòu)造中均有HSP70表達(dá)，而以前者為強(qiáng)。NNK顆粒干擾后，兩組HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示NNK既有可能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)效應(yīng)，同時(shí)也可能在缺血再灌注損傷中發(fā)揮

13、藥物預(yù)適應(yīng)作用。不同時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度分析顯示，缺血72hHSP70表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于24h時(shí)相，而NNK可使72h時(shí)相HSP70減弱幅度變小，提示該藥在調(diào)控HSP70表達(dá)方面有藥理效應(yīng)。由于NNK干擾了IP過程中HSP70的表達(dá)，使得在缺血狀態(tài)中HSP70對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)，因此獲得了較優(yōu)的治療效應(yīng)。綜上所述，NNK不管在IP狀態(tài)中抑制或缺血再灌注狀態(tài)中均能使HSP70表達(dá)增強(qiáng)，扮演了強(qiáng)化IP及藥物預(yù)適應(yīng)角色，旨在增加腦神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧的耐受力，并通過對(duì)HSP70的干擾，獲得穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)造，維護(hù)其正常功能的藥理效應(yīng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1任惠民,周兆年.穩(wěn)定細(xì)胞構(gòu)造的分子根底:熱休克蛋白J.生理科學(xué)進(jìn)展，199