食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 納豆粉

1、DBS 44/XXX -2019第 第 頁(yè)食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 納豆粉范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于納豆粉。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了納豆粉的定義、技術(shù)要求、生產(chǎn)加工過(guò)程的衛(wèi)生要求、標(biāo)簽和包裝。定義納豆粉以大豆為原料，添加或不添加其他輔料，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵、干燥、粉碎等工藝加工而成的粉末狀發(fā)酵豆制品。技術(shù)要求原料要求大豆：應(yīng)符合GB 2715和GB 1352的要求。所有原輔料：應(yīng)符合GB 2761、GB 2762、GB 2763、GB 2763.1以及相應(yīng)食品標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定。感官要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1 感官要求項(xiàng)目要求檢驗(yàn)方法色澤淺黃色至黃褐色取適量試樣置于白色潔凈瓷盤(pán)中，在自然光下觀察色澤、性狀和雜質(zhì)，聞其氣

2、味，品其滋味。氣味、滋味具有納豆粉特有的氣味、滋味，無(wú)異味性狀粉末狀，無(wú)結(jié)塊雜質(zhì)無(wú)正常視力可見(jiàn)外來(lái)雜質(zhì)理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2規(guī)定。表2 理化指標(biāo)項(xiàng)目要求檢驗(yàn)方法納豆激酶a FU/g 2000附錄A 紫外分光光度法IU/g 13000附錄B 瓊脂糖纖維蛋白平板法蛋白質(zhì)b，g/100g 20GB 5009.5水分，g/100g 7.0GB 5009.3灰分，g/100g 6.0GB 5009.4a納豆激酶用附錄A或附錄B其中一個(gè)方法檢測(cè)符合相應(yīng)要求即視為合格。b氮折算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，以6.25計(jì)。污染物限量和真菌毒素限量污染物限量應(yīng)符合GB 2762的規(guī)定。真菌毒素限量應(yīng)符合GB 2761的規(guī)

3、定。微生物限量微生物限量應(yīng)符合GB 2712的規(guī)定。食品添加劑、食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑要求食品添加劑的使用應(yīng)符合GB 2760的規(guī)定。食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的使用應(yīng)符合GB 14880的規(guī)定。生產(chǎn)加工過(guò)程的衛(wèi)生要求應(yīng)符合GB 14881的規(guī)定。標(biāo)簽、包裝標(biāo)簽預(yù)包裝食品標(biāo)簽應(yīng)符合GB 7718 和GB 28050的要求。包裝食品包裝材料或容器應(yīng)符合相應(yīng)食品安全標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)規(guī)定。附錄A 納豆激酶測(cè)定方法-紫外分光光度法范圍本方法適用于納豆粉中納豆激酶的測(cè)定。本方法的檢測(cè)濃度范圍為0.671.33 FU/mL。原理納豆粉中的納豆激酶與纖維蛋白發(fā)生反應(yīng)，使纖維蛋白肽鍵水解。水解反應(yīng)使溶液在紫外光275 nm處吸光度發(fā)生

4、變化。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定水解反應(yīng)前后吸光度的變化，通過(guò)換算間接得出納豆激酶的活力，單位用FU表示。一個(gè)活力單位（1 FU）是指在275 nm下，使吸光度值每增加0.01時(shí)消耗的酶量。試劑配置實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）：分析純；磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）：分析純；氯化鈉（NaCl）：分析純；鹽酸（HCl）：分析純；三氯乙酸（TCA）：分析純；纖維蛋白原：CAS：9001-32-5，SIGMA，提取自牛血漿，產(chǎn)品編號(hào)F8630，規(guī)格：5 g/瓶，含量：65-85%；凝血酶：CAS：9002-04-4，SIGMA，提取自牛血漿，產(chǎn)品編號(hào)T4648，規(guī)格：21

5、.6 mg/瓶，含量：1 KU；醋酸（CH3COOH）：分析純；醋酸鈉（CH3COONa3H2O）：分析純；Triton X-100：分析純；硫酸鈣（CaSO42H2O）：分析純；0.01mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8，含NaCl）精密稱(chēng)取 3.58 g磷酸氫二鈉（Na2 HPO412H2O），加水溶解并稀釋定容至1.0 L，配成溶液A，精密稱(chēng)取0.78 g磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O），加水溶解并稀釋定容至500 mL，配成溶液B，將溶液A和B混合，配成pH值為7.5的磷酸緩沖溶液（約取A液84 mL，16 mL B液）；取上述pH值為7.5的磷酸緩沖溶液與0.9%的氯化鈉溶液

6、混合，混合比例約為1:17，配成pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液。0.2 mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：精密稱(chēng)取32.68 g TCA，用適量去離子水溶解并稀釋至1000 mL即得。0.96纖維蛋白原溶液：移取10 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）至錐形瓶中，加入96 mg纖維蛋白原。超聲使其完全溶解，防止起泡。凝血酶溶液：臨用前用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋50倍。1 mol/L醋酸溶液：精密稱(chēng)取60.1 g CH3COOH，用適量去離子水溶解并稀釋至1000 mL即得。1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 6.0）：精密稱(chēng)取129.6 gCH3COONa3H2O，用約500m

7、L去離子水溶解，向其中加入1 mol/L醋酸溶液至pH=6.0后，用去離子水稀釋至1000 mL即得。10Triton X-100溶液：稱(chēng)取10 g Triton X-100，在加熱條件下用適量去離子水溶解，再補(bǔ)加去離子水至100 mL即得。稀釋劑：精密稱(chēng)取0.334 g（終濃度2 mmol/L）CaSO42H2O和0.585 g（終濃度10 mmol/L）NaCl，用適量去離子水溶解，向其中加入1 mol/L醋酸鹽緩沖液2.0 mL（pH 6.0）以及10Triton X-100溶液0.5 mL（最終濃度為0.005）后，用去離子水稀釋至1000 mL即得。儀器和設(shè)備水浴鍋：（370.5）；

8、分析天平，感量為 0.1 mg超純水儀pH計(jì)渦旋混合器離心機(jī)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/min10 mL離心管紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，配1cm石英比色皿測(cè)試樣品溶液制備準(zhǔn)確稱(chēng)取適量樣品（稱(chēng)樣量根據(jù)不同樣品中納豆激酶的含量而定，大約保證樣品溶液中納豆激酶濃度在0.671.33 FU/mL之間），用稀釋劑溶解，使最終反應(yīng)液的校正吸光度（A）在0.040.08之間。 測(cè)定樣品管將1.4 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.4 mL 0.96纖維蛋白原溶液加至10 mL離心管中，370.5水浴中孵育5 min。取出加入0.1 mL凝血酶溶液并均勻混合。至370.5水浴中孵育10 min。取出加入0.1 m

9、L樣品溶液，渦旋混合5 s，至370.5水浴中孵育60 min。在分別達(dá)到孵育20 min和40 min時(shí)間點(diǎn)時(shí)，分別取出在渦旋混合器上再均勻混合5 s后，繼續(xù)孵育。至反應(yīng)60 min時(shí)，加入2 mL 0.2 mol/L TCA終止反應(yīng)液。將加過(guò)終止反應(yīng)液的樣品管繼續(xù)混合均勻5 s后，于370.5繼續(xù)孵育20 min，使終止反應(yīng)完全。取出樣品液進(jìn)高速離心機(jī)，在12000 rpm條件下離心10 min。用移液管小心移取2 mL上清液至比色皿中，并于275 nm處測(cè)定吸光度（A）。樣品空白管與樣品管 A.5.2.1.1 和 A.5.2.1.2 同樣操作。取出加入2mL 0.2 mol/L TCA

10、終止反應(yīng)液，均勻混合5s。加0.1 mL樣品溶液，均勻混合5 s后，放入370.5水浴中孵育20 min。接 A.5.2.1.5 和 A.5.2.1.6 操作，得樣品空白管吸光度（A0）。結(jié)果計(jì)算樣品中納豆激酶 X（FU/g）按以下公式計(jì)算：X=（A-A0）/（0.01600.1）D式中：A樣品液吸光度；A0空白管吸光度；D樣品的稀釋率，D=定容體積（mL）/稱(chēng)樣量（g）；計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。檢測(cè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)在重復(fù)性條件下獲得的獨(dú)立測(cè)XX果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得超過(guò)20%。分析步驟的關(guān)鍵控制點(diǎn)及說(shuō)明稀釋劑可在室溫下保存 15 天。過(guò)期重配。樣品溶液渾濁時(shí)需過(guò)濾，取濾液測(cè)試。混合均勻操作需配

11、合使用攪拌器。要嚴(yán)格控制酶解反應(yīng)時(shí)間。酶對(duì)樣品反應(yīng)的影響較大。當(dāng)實(shí)驗(yàn)更換了一批纖維蛋白原和凝血酶后，對(duì)同一批樣品而言，結(jié)果有所不同。附錄B 納豆激酶測(cè)定方法-瓊脂糖纖維蛋白平板法范圍本方法適用于納豆粉中納豆激酶的測(cè)定。原理 納豆激酶同尿激酶一樣，是具有纖溶活性的物質(zhì)。在含有凝血酶和纖維蛋白原瓊脂糖平板的固體支架上，樣品中的納豆激酶和尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列同時(shí)發(fā)生溶纖反應(yīng)，形成透明溶圈。以溶圈面積大小的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作回歸曲線(xiàn)，得出相應(yīng)的回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中尿激酶活性大小。樣品中的納豆激酶以尿激酶活性大小IU計(jì)。試劑與試液實(shí)驗(yàn)用水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑磷酸

12、氫二鈉（Na2HPO412H2O）：分析純；磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）：分析純；氯化鈉（NaCl）：分析純；瓊脂糖纖維蛋白原（來(lái)源牛血）：CAS：9001-32-5；凝血酶（來(lái)源牛血）：CAS：9002-04-4；尿激酶：中國(guó)食品藥品檢定研究院試液配制PBS緩沖液的制備：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）：稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）3.58 g，加雙蒸水使溶解并稀釋至1000 mL為液；取磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O） 0.78 g加雙蒸水使溶解并稀釋至500 mL為液；將兩液混合，調(diào)節(jié)至pH值為7.5（液取約84 mL，液取約16 mL）；0.9%

13、氯化鈉溶液：稱(chēng)取氯化鈉9 g，定容至1 L，得到0.9%氯化鈉溶液。將0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）與0.9%氯化鈉溶液（1:17）混合，得到PBS緩沖液。1.5%瓊脂糖溶液：取瓊脂糖1.5 g，加PBS緩沖液100 mL，加熱溶解，50水浴保溫?，F(xiàn)配現(xiàn)用。纖維蛋白原溶液取纖維蛋白原適量，加PBS緩沖液制成每1 mL中含1.5 mg蛋白的纖維蛋白原溶液。注意：緩慢加入PBS緩沖液，防止產(chǎn)生氣泡，加冰超聲溶解。凝血酶溶液取凝血酶適量，加入0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL中含1-2U或1-2BP單位的溶液（根據(jù)不同試劑標(biāo)簽標(biāo)識(shí)單位而定）。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：取尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品，

14、按標(biāo)示效價(jià)加入所需PBS緩沖液溶解，配制的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液為1000 IU/mL，按表B.1繼續(xù)配制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。表B.1尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制尿激酶對(duì)照系列溶液濃度IU/mL尿激酶對(duì)照溶液取樣量LPBS緩沖液取樣量L1000100080080206006040500505040040602002080100109050101902510390注：稀釋后的各標(biāo)準(zhǔn)溶液管應(yīng)采用渦旋震蕩器混合均勻。儀器和設(shè)備游標(biāo)卡尺恒溫水浴鍋超純水儀恒溫培養(yǎng)箱渦旋混合器電子分析天平可調(diào)控電爐超聲儀培養(yǎng)皿（內(nèi)徑14cm）打孔器（直徑3mm）分析步驟樣品溶液的制備：取納豆粉樣品適量（正式檢驗(yàn)前有預(yù)知大約含量），加適

15、量PBS緩沖溶解，樣液濃度稀釋至200400 IU/mL左右。超聲提取15 min后定容至容量瓶刻線(xiàn)。纖維蛋白平板的制備：取B.3.2.3纖維蛋白原溶液39 mL置100 mL燒杯中，于50水浴加熱5 min，邊攪拌邊加入B.3.2.2瓊脂糖溶液39 mL和B.3.2.4凝血酶3.0 mL，立即混勻，快速倒入培養(yǎng)皿，室溫水平放置1小時(shí)。用紙畫(huà)一同培養(yǎng)皿底部相同、直徑為14cm的圓，在圓的中心畫(huà)一直徑為24mm的小圓，以此小圓的圓心為中心點(diǎn)，放上已制備好的平板。用打孔器的不銹鋼小管，在纖維蛋白平板上垂直打孔。所需打孔的數(shù)目為標(biāo)準(zhǔn)系列數(shù)目加樣品（包括平行樣）數(shù)目的和，孔與孔之間保持15mm的距離，

16、以防止溶圈交叉，影響測(cè)量的直徑結(jié)果。測(cè)定：尿激酶對(duì)照曲線(xiàn)點(diǎn)樣：用移液器精密量取B.3.2.5.1表中不同濃度尿激酶對(duì)照溶液各10uL，分別垂直點(diǎn)在B.5.2制備的纖維蛋白平板孔中，并標(biāo)記各點(diǎn)的濃度。納豆粉樣品點(diǎn)樣：根據(jù)預(yù)先估算樣品的納豆激酶大?。蓞⒄找酝臄?shù)據(jù)），稱(chēng)取樣品適量于適當(dāng)?shù)娜萘科恐?，樣品量的大小?yīng)使最終點(diǎn)樣濃度在200400IU/mL左右即可。用移液器精密量取樣品溶液10uL點(diǎn)樣，同時(shí)做1-2個(gè)平行樣。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)系列和樣品溶液同在一個(gè)纖維蛋白平板中點(diǎn)樣，并準(zhǔn)確標(biāo)記樣品號(hào)。點(diǎn)樣完成后蓋上平皿蓋，置于37恒溫箱中反應(yīng)18小時(shí)。溶圈測(cè)量取出平板即刻開(kāi)始測(cè)量溶圈直徑（注：平板取出后溶圈反應(yīng)仍在進(jìn)行中，如測(cè)量時(shí)間拖延較長(zhǎng)，將影響溶圈直徑大小的判斷。將平板放入5冰箱可協(xié)助溶圈反應(yīng)暫時(shí)停止），計(jì)算溶圈面積=R2。以溶圈面積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作回歸曲線(xiàn)，得出相應(yīng)的回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中納豆激酶大小C。計(jì)算樣品中納豆激酶的活性X=CV/M其中：X：樣品納豆激酶，IU/g；C：通過(guò)回歸方程計(jì)算的樣品液中納豆激酶，IU/mL；V：樣品稀釋總體積，mL；M：樣品質(zhì)量，g。分析步驟的關(guān)鍵控制點(diǎn)及說(shuō)明實(shí)驗(yàn)前，所使用的平