F04核酸化學(xué)s課件

1、核酸化學(xué)- 概述- 核酸的結(jié)構(gòu)- 核酸性質(zhì)及研究技術(shù)1 核酸 - 遺傳信息載體- 元素組成特點(diǎn) - 含磷高 (10%)- 基本分類： DNA - 主要遺傳物質(zhì) RNA - 參與遺傳信息 的表達(dá)及調(diào)控1. 概述 introductionBase + Ribose + PiF. Miescher1844-1895 210-12ab 肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Oswald Avery et al. (1944) DNA分子中儲(chǔ)存有遺傳信息注射活有毒菌 致死注射活無毒菌 存活- 有莢膜的光滑型有毒菌- 無莢膜的粗糙型無毒菌轉(zhuǎn)化作用 從一個(gè)供體得到DNA、通過特定途徑轉(zhuǎn)授給另一受體并使后者的遺傳特性發(fā)生相應(yīng)的改變

2、1877-1955310-12ce注射滅活的有毒菌 存活 活無毒菌注射 致死滅活的有毒菌 活無毒菌注射 致死滅活有毒菌的DNA4 噬菌體感染實(shí)驗(yàn)Alfred Hershey and Martha Chase (1952) 10-13用32P和35S分別標(biāo)記DNA和外殼蛋白DNA注入菌體攪拌分離病毒外殼和菌體離心分離及放射性分析釋出子代噬菌體NP in Phys. & Med. 19691928-2003 1908-1997 結(jié)論 用于復(fù)制噬菌體的遺傳信息是通過其DNA而不是蛋白質(zhì)外殼導(dǎo)入細(xì)菌的噬菌體DNA含32P外殼蛋白均無35S5710-1- 兩類堿基均不飽和- 環(huán)呈平面狀- max = 2

3、60 nm嘧啶嘌呤nucleotideconjugateddouble bondwithout it in pyridineimidazole ring核苷酸是核酸的構(gòu)件分子8G11.10/12編號(hào)區(qū)分-N9-糖苷鍵-N1-糖苷鍵順式構(gòu)象時(shí)呈空間位阻nucleoside核苷是(脫氧)核糖的N-(糖)苷rapidly(cf. p159)10核苷酸是核苷的磷酸酯AMP10-62-AMP3-AMP2,3-cAMPnucleotide一定條件下亦可形成兼性離子(cf. p164)11G11.15 NMP磷酸化依次形成NDP和NTP水解時(shí)可釋出更多能量12snake venom3,5-磷酸二酯鍵bovi

4、ne spleen35W34-10 (脫氧)核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接成(脫氧)核酸free dNTPdeoxy-PPi核酸聚合酶DNA/RNA chain(back to 10-36a) used for next attack14Erwin Chargaff 1905-2002 DNA的堿基組成是有規(guī)律的 - 具有種屬特異性 - 同一個(gè)體沒有組織/器官特異性 - 不會(huì)隨個(gè)體的年齡、營養(yǎng)狀況或 環(huán)境變化等而改變Chargaff rules (cf. p168)- 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等：A=T- 鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)相等：G=C- 嘌呤殘基總量與嘧啶殘基的相等：A+G=T+C這

5、一DNA堿基組成的定量關(guān)系暗示著A與T和G與C之間相互配對(duì)的可能性 核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)1510-15 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋模型James Watson & Francis Crick (1953)大溝小溝= 10.5個(gè) 堿基對(duì)original model17G12.9扭 曲- 糖環(huán)平面幾乎與堿基平面成直角- 堿基平面與螺旋長軸垂直- 雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要維系力 a) 雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵 b) 堿基堆積力 = 疏水互作 + 范德華力 (BSF: base stacking force) c) 鏈骨架上負(fù)電性磷酸基團(tuán)提供的鹽鍵18 Key concepts for DNA double hel

6、ix model- 兩條反向(5 3)平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸 纏繞形成右手雙螺旋- 兩條鏈上的堿基通過氫鍵相互連接形成堿基(互補(bǔ))對(duì)， GC, A=T，堿基均呈反式構(gòu)象- 交替的脫氧核糖與帶負(fù)電荷的磷酸骨架位于雙螺旋的 外側(cè)，糖環(huán)平面幾乎與堿基平面成直角- 堿基堆積在雙螺旋內(nèi)部，堿基平面與螺旋長軸垂直， 依靠其疏水性和近似平面的環(huán)結(jié)構(gòu)而緊密疊加在一起- 雙螺旋平均直徑為2nm (實(shí)測(cè)2.37)，相鄰堿基對(duì)距離為 0.34nm (0.33)，相鄰核苷酸夾角為36(34.6)，沿螺 旋長軸每轉(zhuǎn)含10個(gè)(10.4)堿基對(duì)，螺距為3.4nm (3.6)- 堿基對(duì)的堆積和糖-磷酸骨架的扭轉(zhuǎn)導(dǎo)致螺

7、旋表面形成 兩條不等寬的溝(=調(diào)控分子作用處)1910-11ATGC H bonding patterns in base pairs defined by Watson & CrickW-C bps most stable20 DNA雙螺旋具有不同構(gòu)象 10-19 A B Z外形 粗短 適中 細(xì)長螺旋方向 右手 右手 左手螺旋直徑(nm) 2.55 2.37 1.84堿基軸升(nm) 0.23 0.34 0.38堿基夾角() 32.7 34.6 60*堿基數(shù)/圈 11 10.4 12- W-C 模型依據(jù)的是B型- 自然態(tài)DNA多為類B型 間插有短序列A型- 自然存在的Z型很少2124-9/1

8、1/12自動(dòng)形成的額外超螺旋可以抵消過旋或欠旋造成的應(yīng)力 (環(huán)狀)雙螺旋可以形成超螺旋結(jié)構(gòu) relaxedincreased supercoilingbacterial plasmid DNAssupercoil22 tRNA二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)三葉草結(jié)構(gòu)模型 (1965)二氫尿嘧啶假尿嘧啶Robert W. Holley1922-1993 1968 NP in Phys/Med2410-293. 核酸性質(zhì)與研究技術(shù) 核酸雙鏈在體外可以變性和復(fù)性 fastslowzippering變 性DNA雙鏈?zhǔn)茏冃砸蛩赜绊懚箽滏I、堿基堆積力及疏水鍵等破壞、雙螺旋結(jié)構(gòu)解體成單鏈(共價(jià)鍵不斷裂)25H19.17T

9、m與溶液離子強(qiáng)度/pH密切相關(guān) DNA的融解曲線Poly (GC)樣品UV吸收值的增加等于DNA完全變性/解鏈時(shí)的一半- 鹽可屏蔽磷酸骨架的負(fù)電荷 而有利于雙鏈穩(wěn)定及復(fù)性- pH可通過影響堿基解離 而干擾配對(duì)氫鍵的穩(wěn)定82950.14摩爾法分離提純DNP/RNPDNA/RNA2710-32 核酸分子雜交 (hybridization) =不同來源的核酸可以形成雜化體兩種DNA的序列越相似，形成的雜化體越多- Southern Blotting 用探針檢驗(yàn)DNA- Northern Blotting 用探針檢驗(yàn)RNA已知序列并用32P標(biāo)記的DNA/RNA分子/片段28 principle of

10、Southern blotting 將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過程 - 硝酸纖維素膜能同單股DNA/RNA強(qiáng)力結(jié)合29palindrome(b)H19.30- 兩類限制性內(nèi)切酶型既可催化宿主DNA的甲基化、又可切割沒有甲基化的(外源)DNA型只具有核酸酶活性，另有單獨(dú)起甲基化作用的限制性甲基化酶與之配套，催化在同一識(shí)別序列處堿基的甲基化 識(shí)別序列及方向 限制性內(nèi)切酶是一類重要的DNA內(nèi)切酶A殘基在識(shí)別位點(diǎn)甲基化未甲基化的DNA斷裂成黏性末端甲基化酶的高親和性底物自體外源(eg. virus)3010-36aDNA合成酶作用需要 - 模板 - 引物 - dNTP生成磷酸二酯鍵(

11、cf. W34-10) DNA序列可通過雙脫氧鏈終止法測(cè)定3110-36c 雙脫氧鏈終止法 測(cè)定DNA序列(Frederick Sanger, 1977)NP in Chemistry 1980 缺乏繼續(xù)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵的能力前提 電泳技術(shù)已發(fā)展至能夠區(qū)分出僅具有單個(gè)核苷酸差異的DNA片段使同一套片段的末端均固定為同一種核苷酸32- 需要有限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切割DNA- 分離出的DNA片段能與作為載體的外源DNA連接- 有能力鑒別出含有重組DNA的載體克隆 制備外源DNA 在特定位點(diǎn)切割DNA和載體 將外源DNA片段與載體連接 利用載體將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化) 重組DNA在宿主菌

12、內(nèi)大量復(fù)制 篩選和鑒別含有重組DNA的宿主細(xì)胞Paul Berg于1972年將外源DNA片段插入猴病毒SV40環(huán)狀DNA分子內(nèi)而首次獲得DNA體外重組基本前提一般步驟常用E. coli的質(zhì)粒，并以某種抗生素抗性基因標(biāo)記(例如氨芐青霉素抗性基因) 利用特殊修飾酶可以制作重組DNA33H23.1 制作重組DNA 基本步驟key concept用同一種限制性內(nèi)切酶切割外源DNA和質(zhì)粒載體NP in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard

13、 to recombinant-DNA Paul Berg1926-34Kary B. Mullis1944-NP in Chemistry 1993for his invention (1985) of the polymerase chain reaction (PCR) method 每一輪循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍，通常擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106 DNA聚合酶鏈反應(yīng) PCR- 熱變性95, 4560s(起始510 min)- 退火55, 1 min- 延伸72, 1 min(最后10 min)2530 cyclesgetting enoughtarget for DNAanalysis35作