對(duì)流免疫電泳課件

1、對(duì)流免疫電泳武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室熊 潔實(shí) 驗(yàn) 原 理 對(duì)流免疫電泳是雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)的結(jié)合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中帶有電荷，在電場(chǎng)作用下可發(fā)生定向移動(dòng)。將Ag、Ab分別加在pH為8.6緩沖液瓊脂中電泳，因各種血清蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，泳向陽極。由于電滲作用，液體則流向陰極，二者方向相反。 Ab帶負(fù)電荷少，分子量大，所以電泳力小于電滲力，向陰極移動(dòng)。而Ag所帶負(fù)電荷多，分子量較小，故其電泳力大于電滲力，向正極移動(dòng)。 如Ag、Ab相應(yīng)，相遇，在比例適當(dāng)時(shí)即形成白色沉淀線。由于電場(chǎng)限制了AgAb分子的自由擴(kuò)散，因而提高了試驗(yàn)的敏感性(提高1020倍)，并縮短了反應(yīng)時(shí)間（與雙向瓊

2、脂擴(kuò)散相比）。同雙擴(kuò)，可定性確定抗原含量。 材 料抗原：待測(cè)人血清抗體：抗人血清巴比妥緩沖液（0.05 mol/L, Ph 8.6）、1.5%巴比妥緩沖離子瓊脂其他：電泳儀、瓊脂板打孔器、載玻片、毛細(xì)吸管、電表方 法制板：取4 ml 煮沸的1. 5 巴比妥瓊脂，立即澆注在玻片上，制成厚薄均勻的瓊脂板打孔：待瓊脂凝固后，用打孔器按下圖打孔，孔徑3 mm，孔距5 mm。電泳：瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，瓊脂板兩端用濾紙或紗布與緩沖液相接，Ag端接負(fù)極電源，Ab端接正極電源。按電場(chǎng)強(qiáng)度46 V/cm電泳50 min左右。電泳完畢，關(guān)閉電源，取出瓊脂板，在黑色背景下觀察，凡AgAb孔間出現(xiàn)白色沉淀線者為陽性，

3、孔間無白色沉淀線者為陰性。如沉淀線不清晰可將瓊脂板置37溫箱數(shù)小時(shí)后再進(jìn)行觀察，也可染色觀察。在Ag與Ab孔間出現(xiàn)沉淀線者為陽性。沉淀線形狀、位置等差異，與Ag、Ab濃度及分子量有關(guān)。 抗原-抗體反應(yīng)包括凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等。 抗原-抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原；也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。 免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性。 抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn):1. 特異性：抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合2. 可逆性：抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵 結(jié)合3. 階段性：抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 特異性結(jié)

4、合階段 可見的反應(yīng)階段4. 比例性：抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng) 現(xiàn)象與兩者的分子比例密切相關(guān)抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響1 . 電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉 作為稀釋液 ，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2 . 溫度：一般使用反應(yīng)在37度水浴或孵育箱中進(jìn)行。3. 酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度為PH68。1、直接凝集玻片凝集：定性實(shí)驗(yàn)，已知Ab測(cè)未知Ag 用于細(xì)菌和血型鑒定 玻片凝集反應(yīng)是在玻片上將抗體直接與顆粒性抗原物質(zhì)（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）混合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，如兩者對(duì)應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對(duì)應(yīng)便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。

5、試管凝集試驗(yàn)：半定量實(shí)驗(yàn) 已知Ag定量測(cè)Ab 用已知的定量的顆粒性Ag懸液直接與系列稀釋的待檢血清（Ab）在試管內(nèi)混合，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察各管有無凝集，并根據(jù)凝集程度定量測(cè)定血清中的Ab水平及其效價(jià)。2、間接凝集 將可溶性Ag（或Ab）包被在惰性顆粒載體（紅細(xì)胞、乳膠顆粒等）表面，再與相應(yīng)Ab（或Ag）反應(yīng)，出現(xiàn)顆粒物凝集的現(xiàn)象。（二）沉淀反應(yīng)定義：可溶性Ag（如血清蛋白、細(xì)胞裂解液或 組織液等）與相應(yīng)Ab特異性結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物現(xiàn)象。方法：環(huán)狀沉淀 絮狀沉淀 免疫比濁瓊脂凝膠擴(kuò)散： 單向免疫擴(kuò)散 雙向免疫擴(kuò)散 對(duì)流免疫電泳 火箭電泳 免疫電泳單向免疫擴(kuò)散原理 將某種特異

6、性Ab混合于瓊脂凝膠中，制成含Ab的瓊脂板，再于瓊脂板上打孔，并將一定量的Ag加入孔中。 Ag在孔中向四周作輻射狀擴(kuò)散，如Ag與已知的Ab相對(duì)應(yīng)，在兩者比例適合處出現(xiàn)由免疫復(fù)合物所形成的白色沉淀環(huán)。 沉淀環(huán)直徑的大小與Ag的含量成正比。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag與固定濃度的Ab抗體反應(yīng)后測(cè)得沉淀環(huán)的直徑作為橫坐標(biāo)，以Ag濃度為縱坐標(biāo)可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣本沉淀環(huán)的大小，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可推算其含量。主要用于定量測(cè)定抗原或IgG、 IgM、 IgA。雙向免疫擴(kuò)散原理 將可溶性Ag和Ab分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，使兩者各自向四周擴(kuò)散，若Ag與Ab相對(duì)應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生特異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線。每一對(duì)應(yīng)Ag和Ab可出現(xiàn)一條沉淀線，根據(jù)沉淀線的有無、位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可分析Ag或Ab成分。 雙向擴(kuò)散示火箭電泳原理 火箭電泳是單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)Ag的技術(shù)。在含已知Ab瓊脂中打孔，再加入待測(cè)Ag，通電后Ag定向地通過含有Ab的瓊脂，相應(yīng)的Ag和Ab在比例合適處形成沉淀峰。沉淀峰的高度與Ag濃度呈正比。該法可定量檢測(cè)Ag。免疫電泳原理 免疫電泳是電泳和雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種Ag方法。先將