DOC1R基因?qū)π∈蟾顾黾?xì)胞體外作用實驗研究

1、DOC-1R基因?qū)π∈蟾顾黾?xì)胞體外作用實驗研究【摘要】目的研究D-1R基因轉(zhuǎn)染對小鼠腹水瘤細(xì)胞體外生長的作用。方法以pDNA3-D-1R重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠腹水瘤細(xì)胞為試驗組，同時以空載體pDNA3轉(zhuǎn)染為陰性對照組，以非轉(zhuǎn)染組為空白對照，通過四氮唑藍(lán)比色(TT)法檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果T結(jié)果示pDNA3-D-1R轉(zhuǎn)染組活細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，試驗組細(xì)胞生長抑制率與前空白對照和陰性對照組比擬分別是47.5%和45.0%，P0.01；流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示試驗組細(xì)胞凋亡數(shù)那么明顯增多，P0.05。結(jié)論D-1R基因轉(zhuǎn)染可抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞體外生長并誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生?！娟P(guān)鍵詞】D-I

2、R基因腹水瘤細(xì)胞S-180凋亡小鼠D-1(Deletedinralaner-1)是于1995年利用差減雜交法在倉鼠的口腔腫瘤模型中克隆的腫瘤抑制相關(guān)基因1。進一步研究說明此基因與DK2的關(guān)系親密，其功能與DNA的復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)2。隨后，與其相關(guān)的又一腫瘤抑制相關(guān)基因D-1R(D-1related)被克隆，并經(jīng)實驗證明其功能也與DK2相關(guān)，是一種細(xì)胞周期抑制因子3。然而，目前對D-1R基因的功能研究尚少。本研究應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染的方法將小鼠D-1R基因轉(zhuǎn)染小鼠腹水瘤細(xì)胞中，以觀察此基因?qū)π∈蟾顾黾?xì)胞體外生長的影響。1材料與方法11質(zhì)粒和主要試劑小鼠pDNA3-D-1R重組質(zhì)粒的構(gòu)建4，RT-PR

3、試劑盒購自Prega公司，LipfetainePlus脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自LifeTehnlgies公司。12細(xì)胞培養(yǎng)小鼠腹水瘤細(xì)胞S-180購自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫，用含滅活10%小牛血清的培養(yǎng)液RPI-1640，在5%2、37飽和濕度下培養(yǎng)。13基因轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的細(xì)胞,接種于12孔培養(yǎng)板,每孔1106,培養(yǎng)24h后,用無血清的培養(yǎng)基洗滌2次以備轉(zhuǎn)染。試驗分組:以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDNA3-D-1R為試驗組,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDNA3為陰性對照組,未轉(zhuǎn)染為空白對照組。按LipfetainePlus脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明方法進展轉(zhuǎn)染。并經(jīng)RT-PR方法鑒定試驗組細(xì)胞中有D-1R基因的表達(dá)。D-1R

4、基因PR擴增的上下游引物分別為:P1,5-gTgAggTggggATTggTTTgTT-3；P2,5-gAAgATTTggggATgTTAAAATATg-3。14四氮唑藍(lán)快速比色(TT)法測定細(xì)胞生長抑制率將經(jīng)篩癬擴大培養(yǎng)后的各組細(xì)胞分別以每孔1104個接種于96孔板,每組6個復(fù)孔,培養(yǎng)72h后依常規(guī)方法行TT試驗，測定各孔的吸光度值(A550n)，計算各組的平均吸光度值(A550n)。實驗組的生長抑制率IR(%)=(1-實驗組平均A550n/對照組平均A550n)100%。15流式細(xì)胞儀檢測胰酶消化收獲實驗及對照組細(xì)胞,PBS洗滌后，再懸浮在冰冷的反響緩沖液中，細(xì)胞濃度為1104個/l。取1

5、00l細(xì)胞懸液,參加5lFIT-AnnexinV、10lPI(50g/L)室溫避光反響25in后，參加反響緩沖液400l,流式細(xì)胞術(shù)(F)方法對凋亡細(xì)胞進展定量檢測。16統(tǒng)計學(xué)分析試驗數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件包行統(tǒng)計處理。2結(jié)果2.1TT測定結(jié)果各組分別測定550n波長平均吸光度，吸光度值分別是:空白對照組1.2540.152；陰性對照組1.1980.146；試驗組0.6590.096，試驗組活細(xì)胞數(shù)較其他二組均低(P0.05)。試驗組細(xì)胞生長抑制率與前二組比擬分別是47.5%和45.0%，差異均有顯著性，P0.01。2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見表1。表1FIT-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

6、構(gòu)成比注：UL：損傷細(xì)胞；UR：晚期凋亡和繼發(fā)壞死細(xì)胞；LR：早期凋亡細(xì)胞；LL：活細(xì)胞與試驗組比擬*P0.053討論D-1(Deletedinralaner-1)是近年來在口腔腫瘤中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其基因產(chǎn)物與DK2結(jié)合，抑制DK2蛋白的入核轉(zhuǎn)運，從而抑制DK2與ylin形成復(fù)合物，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，被認(rèn)為是一種DK抑制劑(KI)，即細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子。D-1R(D-1related)基因是隨后通過酵母雙雜交法發(fā)現(xiàn)的另一候選抑癌基因。已有的研究發(fā)現(xiàn)D-1和D-1R蛋白都能結(jié)合DNA聚合酶/解旋酶，從而抑制DNA的復(fù)制過程。我們在前期的研究中已經(jīng)克隆了小鼠的D-1R基因序列，小鼠的D-1R

7、基因開放閱讀框架(RF)共有381個堿基，編碼127個氨基酸。同時我們還構(gòu)建了小鼠的D-1R基因正義和反義的表達(dá)載體，初步的研究也發(fā)現(xiàn)D-1R基因可以抑制小鼠NIH3T3細(xì)胞的生長5。然而關(guān)于此基因的更深化的功能研究目前比擬少。本研究中，我們通過基因轉(zhuǎn)染的方法將D-1R基因?qū)胄∈蟾顾黾?xì)胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pDNA3-D-1R重組質(zhì)粒的小鼠腹水瘤細(xì)胞在體外的生長明顯受到抑制，經(jīng)T法測定細(xì)胞的生長抑制率與非轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組比擬均有明顯差異，同時試驗組凋亡的細(xì)胞數(shù)量也明顯增多。研究結(jié)果說明，D-1R基因可以抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞的體外生長并可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。然而關(guān)于D-1R基因抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋

8、亡的詳細(xì)機制和途徑尚有待于今后的進一步深化研究。【參考文獻(xiàn)】1TddR,ebridej,TsujiT,etal.Delatedinralaner-1(d-1),anvelraltursuppressrgene.FASEBJ,1995,9(13)1362-1370.2TsujiT,DuhF,LatifF,etal.lning,apping,expressin,funtin,andutatinanalysesfthehuanrthlgfthehasterputativetursuppressrgeneD-1.JBilhe.,1998,273(12):6704-6709.3ZhangX,TsaH,TsujiT,etal.IdentifiatinandutatinanalysisfD-1R,aD-1grthsuppressr-relatedgene.BiheBiphysre