電泳分離蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)免疫印跡

1、電泳分離蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)免疫印跡第一頁，共27頁。蛋白免疫印跡雜交（Western Blot ）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質(zhì)分析最流行和成熟的技術(shù)之一。 第二頁，共27頁。原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。第三頁，共27頁。第四頁，共27頁。第五頁，共27

2、頁。第六頁，共27頁。30%丙烯酰胺的配制1、稱量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L燒杯中2、向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?、 加去離子水將溶液定容至1 L，用0.45 mm濾膜濾去雜質(zhì)。4. 于棕色瓶中4保存。注意：丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時應(yīng)戴手套、口罩等。聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為有可能含有少量的未聚合成份。第七頁，共27頁。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。 表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 10KD 20-30 1O-4

3、0KD 15-20 1O-100KD 10-15 100KD 5-10 500KD 2-5 第八頁，共27頁。分離膠的聚合（12%）5ml體系蒸餾水 1.634ml30%丙烯酰胺 2.0ml1.5MpH8.8 Tris-SDS 3.7ml10%AP 25ulTEMED 5ul上層加異丙醇壓膠，室溫一小時第九頁，共27頁。積層膠的聚合（5%）2.5ml體系蒸餾水 1.75ml30%丙烯酰胺 0.413ml1MpH6.8 Tris-SDS 0.338ml10%AP 12.5ulTEMED 2.5ul室溫一小時第十頁，共27頁。第十一頁，共27頁。過程圖48/newkj/my/moban2/inde

4、x.htm第十二頁，共27頁。（二）方法 1、制膠：制備凝膠板，將混合后的分離膠溶液，用1ml槍加至距梳齒下緣約1 cm。用1 mL槍在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層異丙醇(約高34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約30-60 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將異丙醇倒去用重蒸水洗凈膠面，將混合均勻后的濃縮膠溶液加入分離膠上方，輕輕插入梳子. 待上層膠聚合，拔出梳子，放入電泳槽，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.3 cm，即可加樣。 2、樣品處理： 樣品經(jīng)反復(fù)凍融裂解，離心，測濃度后，向樣品中加入適量的上樣緩沖液6*SDS，金屬浴105C 10mi

5、n，加樣量一般每個樣品池1040l。 第十三頁，共27頁。3、電泳 將電泳儀與電源接通，打開電泳儀穩(wěn)流，開始時電流約20mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至25-30 mA，當(dāng)溴酚藍染料距底框0.5cm時，停止電泳，關(guān)閉電源4、染色與脫色 電泳結(jié)束后，取下凝膠板，用膠鏟撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記。加入染色液染色1-2 h，再加自來水(加幾滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脫色，則可見蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 第十四頁，共27頁。5、轉(zhuǎn)移電泳：凝膠電泳結(jié)束前30min，將PDVF膜浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。從模具中取出凝膠放在PDVF膜上，驅(qū)除氣泡，然后置于濾紙上放入轉(zhuǎn)移模具中，將模具

6、放入轉(zhuǎn)移電泳槽， PDVF膜一面朝正極，恒壓100伏70min，4電泳過夜，次日取出PDVF膜做好標(biāo)記。 第十五頁，共27頁。六、膜的封閉在進行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脫脂奶等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk.封閉過程：1) 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影

7、響后面的抗體結(jié)合。2) 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉1h，也可在4度過夜。3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.第十六頁，共27頁。七、抗體雜交抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗體進行雜交檢測，標(biāo)記二抗物質(zhì)有放射性核素、酶以及生物素等。雜交過程：）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的一抗，封口，4孵育過夜或室溫（22-25）搖動孵育2h.） 液洗膜3次x10min）標(biāo)記的二抗室溫1h，洗膜3x10min第十七頁，共27頁。八、檢測根據(jù)標(biāo)記二抗的標(biāo)記物不同,其雜

8、交的結(jié)果檢測方法也不同,較常用的檢測系統(tǒng)有增強化學(xué)發(fā)光(ECL)和DAB檢測系統(tǒng).1) 辣根過氧化物酶-DAB法:DAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.顯色:將適量DAB顯色液平鋪在二抗雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶終止:用Tris-HCl緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng).第十八頁，共27頁。2) 辣根過氧化物酶-ECL法：增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì)，其衰變時在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶，利用X線膠片感光原理,將結(jié)果記錄下來。ECL顯色劑配制：按EP管中加顯色劑A

9、、B各1滴,混勻，在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中，加上混合好的顯色液，反應(yīng)1-5分鐘，用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液，將一透明的保鮮膜蓋住撫平，并確定干的表面與膠片接觸。將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鐘，沖洗膠片以確定所測抗原的正確暴光時間，暴光時間可短至幾秒也可以長到數(shù)小時。沖洗膠片步驟：先在顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。第十九頁，共27頁?？捡R斯亮藍和DAB考馬斯亮藍染色：將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中加入少量的染色液，以浸沒凝膠為宜，在搖床上震蕩，直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止，一般5-6小時或者4過夜。然后傾去染色液，用脫色液洗滌

10、震蕩，其間要不斷換脫色液，直至脫色液顏色稍清亮，凝膠背景清楚為止。DAB顯色第二十頁，共27頁。常見問題及解決方案第二十一頁，共27頁。第二十二頁，共27頁。第二十三頁，共27頁。第二十四頁，共27頁。第二十五頁，共27頁。注意事項:免疫印跡雜交的敏感與檢測系統(tǒng)有關(guān)。因此，凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測抗原量不至于太低，如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用，或者建議做一次梯度稀釋，上樣電泳后，直接考馬斯亮藍染色選擇最佳上樣量。形成凝膠的試劑要有足夠的純度，激活劑的濃度適當(dāng)，不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量，凝膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度。因此，建議要根據(jù)不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳，對于濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合。灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合。第二十六頁，共27頁。3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時應(yīng)該戴手套口罩防護。梳子插入濃縮膠時，應(yīng)確保沒有氣泡，可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生，梳子拔出來時應(yīng)該小心，不要破壞加樣孔，如有加樣孔上的凝膠歪斜可用針頭插入加樣孔中糾正，但要避免針頭刺入膠內(nèi)。4. 電泳槽內(nèi)加入