高效液相色譜法講解課件

1、第二章高效液相色譜法一、高效液相色譜法 的特點二、流程及主要部件三、影響分離的因素四、高效液相色譜法 的主要分離類型2022/10/16第二章高效液相色譜法一、高效液相色譜法2022/10/11液相色譜儀（1）2022/10/16液相色譜儀（1）2022/10/11液相色譜儀（2）2022/10/16液相色譜儀（2）2022/10/11液相色譜儀（3）2022/10/16液相色譜儀（3）2022/10/11液相色譜儀（4）2022/10/16液相色譜儀（4）2022/10/11液相色譜儀（5）2022/10/16液相色譜儀（5）2022/10/11一、高效液相色譜法的特點 特點：高壓、高效、高

2、速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2022/10/16一、高效液相色譜法的特點 特點：高壓、高效、高速201高效液相色譜法與氣相色譜法比較（1）應(yīng)用范圍不同 氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；而液相色譜適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70 80%。（2）由于液體的擴散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，而在氣相色譜中氣體的傳質(zhì)速率要快得多。2022/10/161高效液相色譜法與氣相色譜法比較（1）應(yīng)用范圍不同2022（3）液相色譜能

3、完成難度較高的分離工作 氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。 液相色譜固定相類型多，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇，而氣相色譜一般都在較高溫度下進行的。 （4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價格昂貴。2022/10/16（3）液相色譜能完成難度較高的分離工作 氣相色譜的流 2高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)

4、點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。 例如對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。 又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分. 2022/10/16 2高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較 高效液小結(jié) 綜上所述，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。 目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色

5、素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。2022/10/16小結(jié) 綜上所述，高效液相色譜法是吸取了氣相二、流程及主要部件1.流程高壓輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2022/10/16二、流程及主要部件1.流程高壓輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) Agilent 1100 LC的主要部件2022/10/16Agilent 1100 LC的主要部件2022/10/112.主要部件(1) 高壓輸液系統(tǒng)主要部件之一，包括貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等 高壓輸液泵壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很

6、小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一?；疽螅?應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn) 定可調(diào)、耐腐蝕等特性2022/10/162.主要部件(1) 高壓輸液系統(tǒng)2022/10/11(2) 梯度淋洗裝置外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/10/16(2) 梯度淋洗裝置外梯度: 內(nèi)梯度:2022/1(3) 進樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，也可

7、配備自動進樣裝置。 其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/10/16(3) 進樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高(4) 高效分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分，柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/10/16(4) 高效分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動相。(5) 高效液相色譜檢測器 紫外光度檢測器（UVD）：最小檢測量10-9gmL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測器。2022/10/16(5) 高效液相色譜檢測器 紫外光度檢測器（UVD）光電二極管陣列檢測器

8、 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/10/16光電二極管陣列檢測器 光電二極管陣列檢測器：1（6） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 色譜工作站的功能：色譜參數(shù)的選擇和設(shè)定；自動化操作儀器；色譜數(shù)據(jù)的采集和存儲，并作“實時”處理；對采集和存儲的數(shù)據(jù)進行后處理；自動打印，給出一套完整的色譜分析數(shù)據(jù)和圖譜。同時也可把一些常用色譜參數(shù)、操作程序，及各種定量計算方法存入存儲器中，需用時調(diào)出直接使用。 2022/10/16（6） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 色譜工作站的功能：2022/10/12022/10/162022/10/111. 固定相及分離柱 氣相色譜

9、中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。三、影響分離的因素2022/10/161. 固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上2. 流動相及流動相的極性 （1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。 （2）親水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若淋洗液的極

10、性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 2022/10/162. 流動相及流動相的極性 （1）可顯著改變組分分離流動相組成 流動相按組成不同可分為單組分和多組分； 按極性可分為極性、弱極性、非極性； 按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2022/10/16流動相組成 流動相按組成不同可分為單組分和多組分；2選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量

11、雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022/10/16選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動四、 高效液相色譜法的主要分離類型1. 吸附色譜（液-固吸附色譜） “液-固色譜法”是利用各組分在固定相上吸附能力的不同而將它們分離的方法。以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑。流動相可以是各種

12、不同極性的一元或多元溶劑。2. 分配色譜（液-液分配色譜） 早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔體表面。2022/10/16四、 高效液相色譜法的主要分離類型1. 吸附色譜（液-固吸3. 離子交換色譜 固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。 可分離分析：核苷酸、碳水化合物、有機酸、蛋白質(zhì)、酶等 4. 凝膠色譜（空間排阻色譜） 按分子尺寸的差異進行分離的一種液相色譜方法。以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的

13、通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。2022/10/163. 離子交換色譜 固定相為離子交換樹脂，流五、高效液相色譜法的應(yīng)用1. 在食品分析中的應(yīng)用1)食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等；2)食品添加劑分析：防腐劑、著色劑等；3)食品污染物分析：霉菌毒素等。 2. 在環(huán)境分析中的應(yīng)用 多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥殘留等。2022/10/16五、高效液相色譜法的應(yīng)用1. 在食品分析中的應(yīng)用2022/1五、高效液相色譜法的應(yīng)用 3. 在生命科學(xué)中的應(yīng)用 1) 低分子量物質(zhì)，如氨基酸、糖類、維生素等的分離和測定。2) 高分子量物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測定。 4. 在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用1）合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物等。2）天然藥物生物堿（鴉片堿）等5在無機