凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量-PowerPoint

1、凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗目的的掌握凝膠膠層析的的基本原原理。學習利用用凝膠層層析法測測定蛋白白質(zhì)相對對分子質(zhì)質(zhì)量的實實驗技能能。實驗原理理凝膠層析析法也稱稱分子篩篩層析法法，是利利用具有有一定孔孔徑大小小的多孔孔凝膠作作固定相相的層析析技術。當混合合物隨流流動相經(jīng)經(jīng)過凝膠膠層析柱柱時，其其中各組組分按其其分子大大小不同同而被分分離的技技術。該該法設備備簡單、操作方方便、重重復性好好、樣品品回收率率高。凝膠是一一種不帶帶電的具具有三維維空間的的多孔網(wǎng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)、呈珠珠狀顆粒粒的物質(zhì)質(zhì)，每個個顆粒的的細微結(jié)結(jié)構(gòu)及篩篩孔的直直徑均勻勻一致，像篩子子，小的的分子可可以進入入凝膠網(wǎng)網(wǎng)孔，而而

2、大的分分子則排排阻于顆顆粒之外外。當含含有分子子大小不不一的蛋蛋白質(zhì)混混合物樣樣品加到到用此類類凝膠顆顆粒裝填填而成的的層析柱柱上時，這些物物質(zhì)即隨隨洗脫液液的流動動而發(fā)生生移動。大分子子物質(zhì)沿沿凝膠顆顆粒間隙隙隨洗脫脫液移動動，流程程短，移移動速率率快，先先被洗出出層析柱柱；而小小分子物物質(zhì)可通通過凝膠膠網(wǎng)孔進進入顆粒粒內(nèi)部，然后再再擴散出出來，故故流程長長，移動動速度慢慢，最后后被洗出出層析柱柱，從而而使樣品品中不同同大小的的分子彼彼此獲得得分離。若分子子大小介介于上述述完全排排阻或完完全滲入入凝膠的的物質(zhì)，則居二二者之間間從柱中中流出?？傊鞣N不不同相對對分子質(zhì)質(zhì)量的蛋蛋白質(zhì)分分子，最

3、最終由于于它們被被排阻和和擴散的的程度不不同，在在凝膠柱柱中所經(jīng)經(jīng)過的路路程和時時間也不不同，從從而彼此此可以分分離開來來。如果假定定蛋白質(zhì)質(zhì)分子近近于球形形，同時時沒有顯顯著的水水合作用用，則不不同大小小分子量量的蛋白白質(zhì)，在在洗脫時時峰的位位置和該該物質(zhì)相相對分子子質(zhì)量有有直接的的定量的的關系。在一根根凝膠柱柱中，凝凝膠顆粒粒間空隙隙所含水水相體積積為外水水體積V，不不能進入入凝膠孔孔徑的那那些大分分子，當當洗脫體體積為時時V，出現(xiàn)洗洗脫峰。凝膠顆粒粒內(nèi)部孔孔穴的總總體積為為內(nèi)水體體積Vi，能全全部滲入入凝膠的的那些小小分子，當洗脫脫體積為為V+Vi時時，出現(xiàn)現(xiàn)洗脫峰峰。利用Andrews

4、的的實驗經(jīng)經(jīng)驗式：lgMr =a/bVe/bVo式中，Ve為洗洗脫體積積。它是是自加樣樣品開始始到該組組分的洗洗脫峰（峰頂）出現(xiàn)時時所流出出的體積積。Vo為外水水體積，Mr為為相對分分子質(zhì)量量，a和和b為常常數(shù)。葡聚糖凝凝膠有不不同的型型號，用用于分離離不同相相對分子子質(zhì)量大大小的物物質(zhì)。例例如SephardexG-75的分級級范圍是是3000-80000的球球形分子子。在本本實驗中中用于分分離胰島島素（Mr為6000）和牛牛血清蛋蛋白（Mr75000）。儀器和試試劑儀器：層層析柱、恒流泵泵、紫外外檢測儀儀、自動動部分收收集器試劑待測樣品品：胰島島素、牛牛血清白白蛋白藍色葡聚聚糖2000；Se

5、phardex G-75；洗脫劑劑實驗步驟驟1凝膠膠溶脹凝膠顆粒粒要求大大小比較較均勻，可流流速穩(wěn)定定，結(jié)果果較好。取葡聚糖糖Sephardex G-75干干粉，加加過量的的蒸餾水水室溫充充分溶脹脹一天（溶脹時時間因凝凝膠交聯(lián)聯(lián)度不同同而不同同），或或沸水浴浴中溶脹脹3小時時，這樣樣可大大大縮短溶溶脹時間間，而且且可以殺殺死細菌菌和霉菌菌，并可可排出凝凝膠內(nèi)氣氣泡。溶溶脹過程程中注意意不要過過分攪拌拌，以防防顆粒破破碎。待待溶脹平平衡后用用傾瀉法法除去不不易沉下下的細小小顆粒，最后凝凝膠經(jīng)減減壓抽氣氣除去氣氣泡，即即可準備備裝柱。2.裝裝柱與與平衡裝柱前須須將凝膠膠上面過過多的溶溶液傾出出，將

6、層層析柱垂垂直裝好好。關閉閉出口，向柱管管內(nèi)加入入約1/3柱容容積的洗洗脫液，然后在在攪拌下下，將濃濃漿狀的的凝膠連連續(xù)地傾傾入柱中中，使之之自然沉沉降，待待凝膠沉沉降約23cm后，打開柱柱的出口口，調(diào)節(jié)節(jié)合適的的流速，使凝膠膠繼續(xù)沉沉集，待待沉集的的膠面上上升到離離柱的頂頂端約5cm處處時停止止裝柱，關閉出出水口。裝柱要要求連續(xù)續(xù)、均勻勻、無氣氣泡、無無“紋路路”。將洗脫劑劑與恒流流泵相連連，恒流流泵出口口端與層層析柱相相連。通通過23倍柱柱床容積積的洗脫脫液使柱柱床平衡衡，然后后在凝膠膠表面上上放一片片濾紙或或尼龍濾濾布，以以防將來來在加樣樣時凝膠膠被沖起起，并始始終保持持凝膠上上端有一一

7、段液體體。3.上上樣與與洗脫樣品上柱柱是實驗驗成敗的的關鍵之之一，若若樣品稀稀釋或上上柱不均均，會使使區(qū)帶擴擴散，影影響層析析效果。上樣時時應盡量量保持床床面的穩(wěn)穩(wěn)定。先先打開柱柱的出口口，待柱柱中洗脫脫液流至至距床表表面12mm時，關關閉出口口，用滴滴管將1ml樣樣品慢慢慢地加至至柱床表表面，應應避免將將床面凝凝膠沖起起，打開開出口并并開始計計算流出出體積，當樣品品滲入床床中接近近床表面面1mm時關閉閉出口。按加樣樣操作，用少量量（約1ml）洗脫液液沖洗管管壁2次次。最后后加入少少量洗脫脫液于凝凝膠上，使高出出床表面面35cm，旋緊上上口螺絲絲帽，柱柱進水口口連通恒恒流泵，調(diào)好流流速，以以每

8、管3ml/10min流流速開始始洗脫。上樣的的體積，分析用用量為柱柱床容積積的12%；制備用用量為柱柱床容積積的20%30%。4.收收集與鑒鑒定用自動部部分收集集器收集集流出液液，每管管4ml，紫外外檢測儀儀280nm波波長處檢檢測，最最高的一一個OD值時的的體積即即為吸收收峰的洗洗脫體積積Ve。5凝膠膠柱的處處理凝膠用過過后，反反復用蒸蒸餾水洗洗后保存存，如果果有顏色色或比較較臟，可可用0.5mol/LNaCl洗滌滌。短期期可保存存在水相相中，加加入防腐腐劑或加加熱滅菌菌后于低低溫保存存。建議議長期用用干燥狀狀態(tài)保存存。計算 分子量的的測定和和計算，一般都都采用標標準曲線線法。只只要測得得幾

9、種標標準蛋白白質(zhì)相對對分子質(zhì)質(zhì)量的Ve，并并以它們們的相對對分子質(zhì)質(zhì)量的對對數(shù)(logMr)對對Ve作作圖得一一直線，再測出出待測樣樣品的Ve，即即可從圖圖中確定定它的相相對分子子質(zhì)量。注意事項項各接頭不不能漏氣氣，連續(xù)續(xù)用的小小乳膠管管不要有有破損，否則造造成漏氣氣、漏液液。注意意恒壓瓶瓶內(nèi)的排排氣管應應無液體體，并隨隨著柱下下口溶液液的流出出不斷有有氣泡產(chǎn)產(chǎn)生，則則表示恒恒壓瓶不不漏氣。操作過過程中，層析柱柱內(nèi)液面面不斷下下降，則則表示整整個系統(tǒng)統(tǒng)有漏氣氣之處，應仔細細檢查并并加以糾糾正。始終保持持柱內(nèi)液液面高于于凝膠表表面，否否則水分分揮發(fā)，凝膠變變干。也也要防止止液體流流干，使使凝膠混混入大量量氣泡，影響液液體在柱柱內(nèi)的流流動，導導致分離離效果變變壞，不