實驗三微生物染色觀察

1、一 油鏡的使用學習油鏡的使用技術(shù)及維護的基本知識初步認識細菌的基本形態(tài)實驗?zāi)康牡谝豁摚捕?。油鏡使用的原理 油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。浸沒油與玻璃的折射率相近很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的 光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。第二頁，共二十三頁。1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標本時，

2、必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項第三頁，共二十三頁。操作步驟現(xiàn)場演示1.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細調(diào)。依次再進行中倍、高倍觀察2.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看清物象為止。3.換片：另換新片，必須從第1條開始操作。4.用后復原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯

3、擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復原。注意：油鏡使用完畢后一定要用二甲苯擦拭鏡頭用油鏡觀察細菌三形永久裝片。第四頁，共二十三頁。 簡單染色是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。 常用堿性染料進行簡單染色，因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結(jié)合使細菌著色，經(jīng)染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。實驗原理二 細菌的簡單染色第五頁，共二十三頁。 常用作簡單染色的染料有：美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等。 當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培

4、養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。實驗原理 (continued) 細菌細胞微小，透明，不易觀察，需染上顏色。利用單一染料對細菌進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。第六頁，共二十三頁。1、菌種枯草芽孢桿菌1D培養(yǎng)物2、染色劑呂氏堿性美藍染液齊氏石碳酸復紅染液實驗材料 第七頁，共二十三頁。涂片干燥 固定染色水洗干燥鏡檢操作步驟 四、實驗步驟無菌操作第八頁，共二十三頁。菌懸液涂片干燥滴加無菌水固定取菌苔涂片操作步驟（continued） 第九頁，共二十三頁。1、涂片 取兩塊載玻片，各滴一小滴（或用接種環(huán)沾

5、?。┥睇}水（或無菌水）于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作分別從枯草桿菌和金黃色葡萄球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌懸液或液體培養(yǎng)物，可用接種環(huán)挑取1-2環(huán)直接涂于載玻片上。 Notes: 1） 載玻片要潔凈無油跡 2）滴生理鹽水和取菌不宜過多 3）涂片要涂抹均勻，不宜過厚。操作步驟（continued） 第十頁，共二十三頁。3、固定固定的目的：1）使細胞質(zhì)凝固，以固定細胞形態(tài)；2）并使菌體牢固地附著在載玻片上。固定方法：熱固定：涂面朝上，通過火焰數(shù)次注意：溫度不宜過高，以玻片背面不燙手為宜，否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)操作步驟（continued） 2、干燥 室溫自然干燥第

6、十一頁，共二十三頁。4、染色 將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。 美藍染色1-2min；石碳酸復紅染色約1min。操作步驟（continued） 5、水洗倒去染液，用洗瓶（內(nèi)裝自來水）輕輕沖洗，直至涂片上流下來的水無色為止；染色廢液收集在廢液缸中。Note: 水洗時，不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下，水流不宜過急，以免涂片薄膜脫落。第十二頁，共二十三頁。7、鏡檢 細菌個體微小，一般使用油鏡觀察細菌個體形態(tài)。操作步驟（continued） 6、干燥自然干燥或用電吹風吹干，也可用吸水紙吸干。第十三頁，共二十三頁。7、鏡檢（continued）Note

7、s: 必須等涂片完全干后才可滴加香柏油油鏡使用完畢，切記按規(guī)定步驟擦干凈，否則可能損害鏡頭3）擦油鏡鏡頭方法：分三步 A）先用擦鏡紙揩去鏡頭上的香柏油 B）從雙層瓶的下層沾少許二甲苯滴在另一片擦鏡紙上 ，擦拭鏡頭； C）再用一小片擦鏡紙擦去鏡頭上可能殘留的二甲苯。操作步驟（continued） 第十四頁，共二十三頁。三 革蘭氏染色單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。復染色法：用兩種或兩種以上染色液進行染色，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、莢膜染色法等。第十五頁，共二十三頁。革蘭氏染色

8、（Gram stain） 1984年，丹麥醫(yī)生Gram采用革蘭氏染色法細菌細胞壁區(qū)分為兩種類型：革蘭氏陰性（G+）和革蘭氏陽性（G-）革蘭氏染色步驟: 1）結(jié)晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脫色； 4）番紅復染第十六頁，共二十三頁。 G菌：細胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性屏障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復合物在細胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復合物溶出細胞壁，番紅復染后呈紅色。革蘭氏染色的實驗原理第十七頁，共二十三頁。細菌的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)芽孢：休眠體，不利環(huán)境下產(chǎn)生，耐受各種極端

9、環(huán)境。莢膜：多糖，包裹在菌體外圍，保護菌體鞭毛：運動，菌落形態(tài)。第十八頁，共二十三頁。實驗材料大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（2 day培養(yǎng)物）革蘭氏染色液一套第十九頁，共二十三頁。實驗步驟革蘭氏染色枯草桿菌的芽孢染色繪圖、寫實驗報告第二十頁，共二十三頁。革蘭氏染色的步驟1. 涂片2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約1520秒，后立即用流水沖洗。5. 復染：滴加番紅染色液，染35分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。第二十一頁，共二十三頁。Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. Figure 2 - Gram stain of Gram E. coli cells第二十二頁，共二十三頁。四 芽孢的染色1、制備菌液：加2-4滴蒸餾水于小試管中，用接種環(huán)從斜面挑取菌體2環(huán)于試管中充分混勻。2、加染色液：加孔雀