乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)課件

1、乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測(cè) 繆曉輝2009.5乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測(cè) 一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)三、需要重視的幾個(gè)問(wèn)題乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)課件一、HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐藥（genotypic resistance） HBV表型耐藥（phenotypic resistance） 臨床耐藥（clinical resistance） 一、HBV耐藥的有關(guān)定義

2、HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough）指在核苷類藥物治療過(guò)程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA水平與最低值相比上升或超過(guò)1個(gè)log10（10倍）。HBV耐藥的有關(guān)定義HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒反跳（viral rebound）指核苷類藥物治療過(guò)程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治療前水平。 HBV耐藥的有關(guān)定義HBV耐藥的有關(guān)定義 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough）指在核苷類藥物治療過(guò)程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（A

3、LT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV基因型耐藥（genotypic resistance）指HBV基因組中的某些位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對(duì)HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過(guò)這些變異位點(diǎn)的檢測(cè)可判斷HBV有無(wú)耐藥性。 HBV耐藥的有關(guān)定義HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotypic resistance）通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測(cè)定HBV對(duì)某種藥物的敏感性，或者在體外直接測(cè)定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降

4、均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來(lái)評(píng)估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐藥 IC50 10倍:耐藥HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotyHBV耐藥的有關(guān)定義 臨床耐藥（clinical resistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBV DNA反跳，同時(shí)伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。 HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)HBV表型耐藥檢測(cè)臨床耐藥監(jiān)測(cè)二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)基于對(duì)血清HBV DNA載量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需重視以下三點(diǎn)： 1.

5、HBV DNA載量檢測(cè)手段的敏感性 2.檢測(cè)技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性 3.監(jiān)測(cè)的間隔時(shí)間病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法 直接測(cè)序 克隆測(cè)序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）基因芯片技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù) 引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù) 熔解曲線法 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間

6、質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法直接測(cè)序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過(guò)PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠。安全、無(wú)放射性污染。模板用量大大減少。測(cè)序能力增強(qiáng)。 直接測(cè)序法末端終止

7、法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物HBV YMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜HBV YMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜直接DNA測(cè)序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測(cè)序法檢測(cè)HBV YMDD變異1.JPG直接DNA測(cè)序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)?？寺y(cè)序法克隆測(cè)序法克隆測(cè)序法優(yōu)點(diǎn)： 1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株 之間的相對(duì)比。 2.提高了檢測(cè)的靈敏度。局限性： 1.技術(shù)難度較高。 2.檢測(cè)周期更長(zhǎng)。 3.檢測(cè)的費(fèi)用大大增加?？寺y(cè)序法優(yōu)點(diǎn)： 堿基變異可能導(dǎo)致： 原有位點(diǎn)消

8、失 產(chǎn)生新的位點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)移位 利用錯(cuò)配引物使 PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生 特異的酶切位點(diǎn)結(jié)果: 酶切片段長(zhǎng)、短變化和多、少變化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP) 堿基變異可能導(dǎo)致：結(jié)果: 酶切片段長(zhǎng)、短變化和多限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：Nde I限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CA TATGGTAT ACNla Ill限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CATG NNNGTAC NNN限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)PCR-RFLP檢測(cè)HB

9、V YMDD變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR-RFLP技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單、廣泛易開展。缺點(diǎn)： 1.限制性內(nèi)切酶種類有限。 2.錯(cuò)配引物將導(dǎo)致退火溫度降低、非特異條帶增多。 3.引物非完全匹配，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低、檢測(cè) 敏感的下降。 PCR-RFLP技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）INNOLiPA診斷HBV YMDD變異INNOLiPA診斷HBV YMDD變異DNA芯片技術(shù)Biol

10、ogicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarray fabricationSample preparationMolecular hybridizationDetection and analysisDNA芯片技術(shù)BiologicalAnalyze dataSDNA芯片技術(shù)診斷HBV YMDD變異Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepa

11、titis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.DNA芯片技術(shù)診斷HBV YMDD變異Detection oDNA芯片技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 局限性 大通量 技術(shù)和設(shè)備的要求高 快速 檢測(cè)成本高 靈敏度高 可平行檢測(cè) DNA芯片技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 局實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)高分辨熔解曲線法實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)-Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針技術(shù)檢

12、測(cè)YMDD變異HBV DNA105copies/mlW:M=1:1HBV DNA105copies/mlW:M=10:1HBV DNA探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 不足 靈敏度高 需要相對(duì)較貴的熒光PCR儀 特異性好 需要多條熒光探針，成本高 費(fèi)時(shí)短 影響因素多，存在一定誤判探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)YMDD變異引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)YMDD變異熔解曲線法檢測(cè)YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析熔解曲線法檢測(cè)YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(M

13、ALDI-TOF MS)原理基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS檢測(cè)HBV YMDD變異的原理酶切分子量.JPGMALDI-TOF MS檢測(cè)HBV YMDD變異的原理酶切基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF MS)優(yōu)點(diǎn)： 高靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率 能發(fā)現(xiàn)相對(duì)比例小于1%的變異株。局限性： 設(shè)備昂貴，目前國(guó)內(nèi)難以用于臨床檢測(cè)?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF MSHBV耐藥不同檢測(cè)技術(shù)的比較Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Re

14、sistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-161Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Upda

15、teability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined.HBV耐藥不同檢測(cè)技術(shù)的比較Advances in MoleHBV表型耐藥檢測(cè)有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。HBV表型耐藥檢測(cè)有兩種途徑：細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而表達(dá)HBV顆粒，應(yīng)用親

16、和層析法純化HBV顆粒后，在細(xì)胞外評(píng)價(jià)藥物對(duì)聚合酶活性的影響。細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病毒載體將含有被檢測(cè)的含HBV變異位點(diǎn)的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞上清中的HBV DNA含量。 細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。

17、 細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需臨床耐藥監(jiān)測(cè)YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化臨床耐藥監(jiān)測(cè)YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化HBV MDD變異與病毒學(xué)突破HBV MDD變異與病毒學(xué)突破判斷臨床耐藥時(shí)的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點(diǎn)。 判斷臨床耐藥時(shí)的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載三、需要重視的幾個(gè)問(wèn)題慎重對(duì)待天然耐藥的結(jié)論。不要過(guò)分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù)。正確對(duì)待基因分型技術(shù)。 三、需要重視的幾個(gè)問(wèn)題慎重對(duì)待天然耐藥的結(jié)論。YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu

18、M等采用InnoLipa 法檢測(cè)71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結(jié)果有13例檢測(cè)到Y(jié)MDD變異株。Lee CZ等采用引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)對(duì)28例拉米夫定治療前的CHB患者血清進(jìn)行了YMDD變異毒株檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有16例（57.1%）存在YMDD自然變異毒株。日本Kobayashi等檢測(cè)18例無(wú)癥狀HBV攜帶者,發(fā)現(xiàn)5例YMDD變異,占27.78%。YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu M等采用InnoLi本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于YMDD自然變異的2組數(shù)據(jù)196例CHB患者中，檢出存在YMDD變異毒株者共21例，檢出率為10.7%。其中YVDD陽(yáng)性20例，YIDD陽(yáng)性1例，YVDD和YIDD同時(shí)

19、陽(yáng)性者0例。183例CHB患者中，檢出存在YMDD突變毒株者共40例，檢出率為21.86%。其中YVDD陽(yáng)性36例，YIDD陽(yáng)性3例，YVDD和YIDD同時(shí)陽(yáng)性者1例。VS本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于YMDD自然變異的2組數(shù)據(jù)196例CHB患者中不要過(guò)分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù) 基因型耐藥變異并非必須。目前我國(guó)尚無(wú)SFDA批準(zhǔn)的商品化試劑盒或被普遍認(rèn)可的檢測(cè)技術(shù)。 不要過(guò)分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù) 基因型耐藥變異并非必須。正確對(duì)待HBV基因型與核苷類似物療效之間的關(guān)系 基因型是一種人為的分類方式。 HBV的基因型與各種核苷類藥物的療效之間的關(guān)系還沒有確定的結(jié)論。P區(qū)基因的變異對(duì)S區(qū)基因的影響。 正確對(duì)待HBV基因型與核苷類似物療效之間的關(guān)系 基因型是一結(jié)語(yǔ)加深認(rèn)識(shí)適時(shí)監(jiān)測(cè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)正確管理 結(jié)語(yǔ)加深認(rèn)識(shí)謝謝！謝謝！綠葉底下防蟲害，平靜之中防隱患。10月-2210月-22Monday, October 17, 2022脆弱的生命需要安全的呵護(hù)。02:01:5702:01:5