分子生物學(xué)討論人類基因組DNA提取課件

人類DNA基因組提取

分子生物學(xué)第一次討論蔣伯岳朱之苑崔增楨1人類基因組DNA提取的原理

哺乳動物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì)胞；有時為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛膜細(xì)胞。2人類基因組DNA提取的原理●人類基因組DNA提取應(yīng)考慮以下原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞，保持DNA分子的完整；（3）將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。3DNA整體表現(xiàn)為酸性，帶負(fù)電。是極性化合物，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有機(jī)溶劑，形成沉淀。從而被分離提取出來。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀，從而被除去。人類基因組DNA提取的原理4人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取●從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取●從胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛膜細(xì)胞中提?。ǔＳ糜诋a(chǎn)前診斷）5在5mL15mmol/LTES溶液中懸浮白細(xì)胞，加蛋白酶K250一350微克，10%SDS260微升，充分混勻，置37℃過夜。酚醇法從全血中提取DNA7冷卻至4℃加等體積Tris飽和酚，充分混勻，4℃3000r/min離心30min吸取上層溶液移至另一離心管。加等體積Tris飽和酚，重復(fù)上一步Tris飽和酚抽提。酚醇法從全血中提取DNA8EDTA：是一種血液抗凝劑，同時抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。SDS：10%（W/V）十二烷基硫酸鈉：是一種去污劑，能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來。酚：是蛋白質(zhì)的變性劑，并將變性的蛋白質(zhì)溶解其中。而DNA則溶解于水相。氯仿：是蛋白質(zhì)的變性劑，促進(jìn)兩相分離，并除去DNA溶液中的酚。試劑作用10蛋白酶K溶液：是一種很強的蛋白水解酶，在SDS中穩(wěn)定。水解各種蛋白質(zhì)（包括糖蛋白和肽類，和脂類，胺類物質(zhì)）。同時由于RNA酶和DNA酶是蛋白質(zhì)，也可被水解，從而防止DNA被水解。無水乙醇：使DNA析出75%乙醇：洗滌DNA沉淀試劑作用11用于盛放檢測化學(xué)成分、藥物殘留、病毒種類等化學(xué)試劑的盒子。試劑盒的產(chǎn)生正是為了使實驗人員能夠擺脫繁重的試劑配制及優(yōu)化過程，所以試劑盒中一般配備有相應(yīng)的使用說明書，用戶按照說明書不需或只需少量的優(yōu)化即可得到滿意的結(jié)果。試劑盒12限制性核酸內(nèi)切酶切割原理、方法及結(jié)果分析1、定義：

1、定義：限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶的分類及特點類型限制性修飾作用識別位點切割位點Ⅰ型有有特異識別位點下游100到1000bpⅡ型有無特異可知、固定Ⅲ型有有特異識別位點附近切割DNA，切割位點很難預(yù)測。17規(guī)則：第一個字母（大寫）：取自該酶的細(xì)胞屬名第二、三個字母（小寫）：該細(xì)胞的種名第四個字母（羅馬數(shù)字）：代表同一菌株中不同限制性內(nèi)切酶的編號例如：EcoRⅠ、HindⅢ等內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶切割原理1、Ⅰ類和Ⅲ類酶：在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機(jī)的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。2、Ⅱ類由兩種酶組成：一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列通常是4～6個堿基對、具有回文序列（palindrome）的DNA片段；另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。一般需要較純的底物DNA\Mg2+\Tris-HCl緩沖液，通常在37℃保溫以酶解DNA。

限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析：同一DNA用不同的限制酶進(jìn)行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點，由此建立的位點圖譜有助于對DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。方法：EcoRI和BglⅡ有兩種類型，即表中的I型和Ⅱ型。操作方法：病毒DNA的提取和純化當(dāng)繁殖病毒的細(xì)胞出現(xiàn)80%-100%的細(xì)胞病變時(CPE)，收獲并凍融三次使細(xì)胞破裂釋放出病毒，3000r/min離心10分鐘，吸出上清，加10%SDS至終濃度為1%，于56℃水浴作用30分鐘，加等體積的飽和酚，混勻10000r/min離心10-15分鐘，取上清反復(fù)抽提至界面無蛋白質(zhì)為止，取上清用乙醚去酚數(shù)次，真空除去乙醚，然后加2.5倍預(yù)冷無水乙醇，沉淀核酸，12000r/min離心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗滌兩次，pH8.0TE緩沖液溶解，取少量用紫外分光光度計測其含量和純度，其余置－20℃貯存?zhèn)溆谩?、電泳依據(jù)酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠作為支持物進(jìn)行電泳，同時加入標(biāo)準(zhǔn)DNA作分子量參照物，經(jīng)溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應(yīng)的光源下觀察結(jié)果并拍攝記錄電泳圖譜。以上為酶切反應(yīng)操作的基本過程。如果進(jìn)行多酶切反應(yīng)，則要考慮反應(yīng)緩沖液要基本適用于所用的各種酶。若兩種以上的酶對緩沖液要求不同，如鹽濃度要求不同時，先進(jìn)行低鹽要求的酶切反應(yīng)，再進(jìn)行高鹽要求的反應(yīng)，對反應(yīng)溫度要求不一的也是先進(jìn)行低溫度酶切，再進(jìn)行高溫度酶切。什么是瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)使用瓊脂糖凝膠作為固體介質(zhì)。從海藻提取出的瓊脂中可以分離出一種膠狀多糖，稱為瓊脂糖。瓊脂糖通常為自色粉末，有時稍帶色。它的主要成分為交替連接的D-吡喃半乳糖和3，6-脫水-L-吡喃半乳糖基。瓊脂糖分子中含有很多羥基，羥基之間的氫鍵使瓊脂糖分子聚集，成為形成凝膠的主要作用力。分子量不同或構(gòu)型不同的DNA分子的電泳速率不同，因此可以分離開來。由于DNA本身無色，所以需要加入一種有色指示劑，來幫助人們確定它移動到了什么位置。所用指示劑一般分子量很小，電泳速率較快，跑在泳帶的最前端，可以根據(jù)它的位置及時終止電泳。實驗中還需要加入某種熒光染色劑，它與DNA的結(jié)合體在紫外光照射下發(fā)出熒光，從而將分離出的DNA條帶顯示出來。圖1就是加有熒光染色劑的樣品在紫外光下拍攝的照片。將實驗樣品與DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品同時電泳，比對2者的條帶位置，就可以鑒定分離出的DNA的分子量或構(gòu)型。瓊脂糖凝膠電泳原理1、瓊脂糖為鏈狀多糖→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型凝膠——分離、鑒定、純化DNA2、影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成1、瓊脂糖為鏈狀多糖→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型凝膠——分離、鑒定、純化DNA2、影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成范海榮，夏永靜，孫福成，何青；四種全血基因組DNA提取方法的比較；中國動脈硬化雜志2002年第10卷第6期陳昆明，夏葉子，章圣輝，陳為安，胡聽，楊慧民，何金彩，楊德業(yè)；經(jīng)典酚/氯仿抽提法和純化試劑盒法提取全血基因組DNA的比較；浙江醫(yī)學(xué)2010