實(shí)驗(yàn)八 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及

實(shí)驗(yàn)八細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物生長(zhǎng)一、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及★細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線就是把一定量的菌體細(xì)胞接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在此過程中，其細(xì)胞數(shù)目將隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)而發(fā)生規(guī)律性的變化，如以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)值（或O.D?值）為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作一條曲線，即為細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，它反映了細(xì)菌的群體生長(zhǎng)規(guī)律。★大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，可把細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線劃分為延滯期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)時(shí)期?！镂⑸颫D值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是opticaldelnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400?700nm都是微生物測(cè)定的范圍，505nm測(cè)菌絲菌體、560nm測(cè)酵母、600nm測(cè)細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的方法是，將待測(cè)菌種接入一只大試管的培養(yǎng)液中，在適宜的培養(yǎng)溫度和良好的通氣狀態(tài)下，定時(shí)取出此試管，在600納米波長(zhǎng)處測(cè)定菌液濃度（O.D.值），在一定的范圍內(nèi)，菌液濃度與光密度值成線性關(guān)系。因此，根據(jù)菌液的O.D.值可以推知細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的進(jìn)程。將所測(cè)得的一組O.D.值與其相應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪制出該菌的生長(zhǎng)曲線?！顚?shí)驗(yàn)操作1、 菌種培養(yǎng)：取大腸桿菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（LB）中，靜止培養(yǎng)12--14h，備用。2、 制備LB培養(yǎng)基100ml置于200ml三角瓶?jī)?nèi)，備用。3、 標(biāo)記：取11支無菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。4、 接種：分別用5ml無菌吸管吸取5ml大腸桿菌培養(yǎng)液（培養(yǎng)12~14h）轉(zhuǎn)入盛有100mlLB液的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌大試管中。5、 培養(yǎng)：將已接種的試管置搖床37°C振蕩培養(yǎng)（振蕩頻率250r/min）,分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存,最后一同比濁測(cè)定其光密度值。6、 比濁測(cè)定：用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)（測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布）。7、 繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。二、血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物生長(zhǎng)★基本原理血球計(jì)數(shù)板是一塊特別的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴。中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表面比兩個(gè)平臺(tái)的表面高0.1mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央1mm2面積上刻有400個(gè)小方格。血球計(jì)數(shù)板有兩種規(guī)格，一種是將1cm2面積分為25個(gè)大格，每大格再分為16個(gè)小格（25x16）；另一種是16個(gè)大格，每個(gè)大格再分為25個(gè)小格（16x25）。兩者都是總共有400個(gè)小格。當(dāng)專用蓋玻片置于兩條嵴上，從兩個(gè)平臺(tái)側(cè)面加入菌液后，400個(gè)小方格（1mm2面積）計(jì)數(shù)室上形成0.1mm3的體積。通過對(duì)一定大格內(nèi)微生物數(shù)量的統(tǒng)計(jì)。可計(jì)算出1mL菌液所含的菌體數(shù)。在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號(hào)和數(shù)字，其含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25大格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2，分400個(gè)小格，每小格面積是1/400mm2。A■血球計(jì)數(shù)板的止面吐血球計(jì)數(shù)板的側(cè)面圖1血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造Lr二ui[1P1Lr二ui[1P1ZrHrnT■卜-JLJ■L二L二r丄qF-二-iL1凡2弔衣格x"水格計(jì)散板K"大格x瓷小格計(jì)數(shù)扳圖2兩種不同刻度的計(jì)數(shù)板本方法適用于酵母菌和霉菌抱子的數(shù)量測(cè)定。若要測(cè)定細(xì)菌數(shù)量時(shí)誤差較大。本法測(cè)得的是菌體總數(shù)、不能區(qū)分是活菌體還是死菌。★實(shí)驗(yàn)操作1、血球計(jì)數(shù)板的操作取清潔的血球計(jì)數(shù)板，將潔凈的專用蓋片置兩條嵴上。將釀酒酵母菌在液體培養(yǎng)基上適溫培養(yǎng)24-48h，然后將培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，以每小格有3-5個(gè)酵母菌為宜。搖勻稀釋的酵母菌液，用無菌滴管吸取少許菌液，從蓋片的邊緣滴一小滴(不宜過多)，使菌液自行滲入平臺(tái)的計(jì)數(shù)室。加菌液時(shí)注意不得使計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡兩個(gè)平臺(tái)上都滴加菌液后，靜置約5min。在低倍鏡下找到方格網(wǎng)后，轉(zhuǎn)換高倍鏡進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。2、計(jì)數(shù)方法不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)方法略有差異。16x25規(guī)格的計(jì)數(shù)板，需要按對(duì)角線方位，計(jì)算左上、左下、右上和右下4個(gè)大格(共100小格)的酵母菌數(shù)。若是25x16規(guī)格的計(jì)數(shù)板，除統(tǒng)計(jì)上述4個(gè)大格外，還須統(tǒng)計(jì)中央一大格(共80小格)的酵母菌數(shù)。酵母菌的芽體達(dá)到母體細(xì)胞大小的一半者，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。位于兩個(gè)大格間線上的酵母菌，只統(tǒng)計(jì)此格的上側(cè)和右側(cè)線上的菌體數(shù)。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則重新操