分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)縮減版

如何充分混勻冷凍細胞團塊能否集中提取RNA振蕩強度界面層取舍與產(chǎn)率和純度RNA提取操作細節(jié)容易出問題環(huán)節(jié)同mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA1.

引物、用途2.

模板：3.

dNTP4.

反轉(zhuǎn)錄酶選擇：總RNA樣）PCR獲得目的片段非定向片段定向

片段引物中引入酶切位點設(shè)計原則提問：需要考慮幾方面的因素？向一如果目的片段中含有不能避開的酶切位點怎么辦？通過

操作對目的片段/載體進行改造目的片段進行改造要考慮：P2X7AGAGTAATC

TACOverlap

PCR法獲得重組質(zhì)粒構(gòu)建W(M)P2X7表達重組質(zhì)粒目的片段進行定點突變GAGATTGAAATCGAGATCGAGATAde構(gòu)建W(M)P2X7單表達重組質(zhì)粒Overlap

PCR法獲得去BglⅡ位點的P2X7片段GAG

GAAP2X7目的片段進行定點突變PCR產(chǎn)物鑒定提問：PCR產(chǎn)物需要鑒定嗎？成做到何種程度？如何選擇內(nèi)切酶？酶切鑒定后是否足夠？PCR產(chǎn)物純化提問：PCR產(chǎn)物能直接酶切連接嗎？為何？模版、體如何純化？提問：PCR后測OD估算產(chǎn)物的量可以嗎？為何？PCR產(chǎn)物切膠純化提問：電泳、切膠、回收注意事項電泳：切膠：回收：分子量大吸附能力強

太大或者太小的片段研究變異性質(zhì)利用PCR方法獲得變異片段到引物中。將目的序列Overlap

PCR。****去除中間較大片段或連接兩個無關(guān)片段針對氨基酸進行定點突變二.目的片段與載體的連接質(zhì)粒提問：質(zhì)粒？有無辦法提高質(zhì)粒產(chǎn)量？提質(zhì)粒提出兩種是怎么回事？?質(zhì)粒和質(zhì)粒的停質(zhì)粒不相容性與質(zhì)粒特點不同。不質(zhì)粒的提取提問：堿變性法的基本原理特DNA提問：溶液1、2、3起什么作用？操作關(guān)鍵降提問：如何確定質(zhì)粒分子量？T載體提問：T載體是什么樣的載體？提問：T載體能直接在細菌中嗎？如何提問：用途？限制？提問：連接效率？目的片段與載體的連接載體與片段的連接提問：通常連接反應(yīng)需要多少載體及片段？的載（提問：連接條件？提問：粘性末端連接策略？切后提問：平末端連接策略？三.

細菌轉(zhuǎn)化提問：常用于克隆的菌株有哪些？特點？高缺乳提問：什么情況下會出現(xiàn)菌落？為什么？提問：轉(zhuǎn)化過程中16小時無菌落，繼續(xù)培養(yǎng)到30小時后出現(xiàn)小菌落怎么辦？往不長提問：α互補？U提問：挑選什么樣的克?。刻釂枺褐亟M質(zhì)粒需要進行哪些鑒定？特點：快；缺點：可能有假陽性。電質(zhì)粒上所包含的酶切位點進行單酶切或雙酶切；目的片段上所含的酶切位點進行單酶切；采用質(zhì)粒上及目的片段上的酶切位點進行雙酶切鑒定外源蛋白的表達策略優(yōu)缺點？關(guān)注點？?優(yōu)缺點？?關(guān)注點？優(yōu)點：操作容易、周期短、產(chǎn)量高。缺點：

無糖基化、

活性（容易形成包含體）去掉