《細(xì)胞工程》第4章(3)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程4

細(xì)胞工工程CellEngineeringChapter4、動(dòng)物物細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)工程程4．1概述4．2生產(chǎn)用用動(dòng)物物細(xì)胞胞系4．3培養(yǎng)液液和培培養(yǎng)環(huán)環(huán)境4．4動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)工工藝4．5動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)過(guò)過(guò)程的的放大大與優(yōu)優(yōu)化4．6動(dòng)物細(xì)細(xì)胞代代謝工工程4．7動(dòng)物細(xì)細(xì)胞工工程產(chǎn)產(chǎn)品制制備及及質(zhì)控控4．8動(dòng)物細(xì)細(xì)胞工工程表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)品的的應(yīng)用用4．5動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)過(guò)過(guò)程的的放放大大與優(yōu)優(yōu)化4．5．1動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)工工藝的的研究究A、開發(fā)發(fā)重要要性：：真核細(xì)細(xì)胞表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物糖糖基化化，有有療效效；動(dòng)物細(xì)細(xì)胞體體外培培養(yǎng)廣廣泛應(yīng)應(yīng)用于于基因因工程程蛋白白質(zhì)與與病毒疫苗苗等生生產(chǎn)；；動(dòng)物物細(xì)胞胞表達(dá)達(dá)產(chǎn)品品十分分昂貴貴，開開發(fā)周周期長(zhǎng)，研研發(fā)成成本高高，技技術(shù)難難度大大；如如：美美國(guó)，，Immunex公司，已已被Amgen公司兼兼并，，生產(chǎn)產(chǎn)治療療風(fēng)濕濕性關(guān)關(guān)節(jié)炎炎蛋白白藥物，，2.6g/人、年年×6154美元/g=16000美元，，2002年，銷售額額達(dá)8.02億美元元，其其中，，被替替代損損失10億，因因?yàn)楫a(chǎn)產(chǎn)量低，，計(jì)劃劃投入入數(shù)億億美元元，耗耗時(shí)3-5年，擴(kuò)擴(kuò)大規(guī)規(guī)模、、優(yōu)化生產(chǎn)產(chǎn)工藝藝，提提高產(chǎn)產(chǎn)量。。B、主要要內(nèi)容容：生產(chǎn)工工藝的的放大大、生生產(chǎn)工工藝的的穩(wěn)定定性和和重復(fù)復(fù)性。。C、初步步研究究：首先必必須較較快建建立一一個(gè)基基本（（不要要求是是最優(yōu)優(yōu)）的的細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)工藝藝。4．5．2動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)工工藝的的優(yōu)化化A、影響響蛋白白質(zhì)產(chǎn)產(chǎn)量的的關(guān)鍵鍵參數(shù)數(shù)，營(yíng)營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)物耗耗盡；；B、決定定細(xì)胞胞濃度度有毒廢廢物的的積累累的關(guān)鍵鍵參數(shù)數(shù)培養(yǎng)物物理?xiàng)l條件的的惡化化提高蛋蛋白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)水平平C、細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)工藝藝細(xì)胞新新陳代代謝的的控制制優(yōu)化策策略流加工工藝的的優(yōu)化化4．5．3動(dòng)物細(xì)細(xì)胞培培養(yǎng)工工藝的的放大大A、生物物反應(yīng)應(yīng)器尺尺寸放放大鼓泡B、氧氣氣的傳傳輸提高氧氧氣傳傳遞的的其它它方法法攪拌速速率和和攪拌拌器的的設(shè)計(jì)計(jì)C、混合合剪切力力和細(xì)細(xì)胞損損傷D、工業(yè)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)中的的動(dòng)物物細(xì)胞胞培養(yǎng)養(yǎng)4．6動(dòng)物細(xì)細(xì)胞代代謝工工程4．6．1概述A、生命命的代代謝活活動(dòng)是通過(guò)過(guò)活細(xì)細(xì)胞和和細(xì)胞胞群的代代謝網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)進(jìn)行的的，后后者由由一系系列酶酶催化化的級(jí)聯(lián)聯(lián)化學(xué)學(xué)反應(yīng)應(yīng)以及及特異異性的的膜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移系系統(tǒng)所所構(gòu)成。。然后后，活活細(xì)胞胞這種種自身身固有有的代代謝網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)相對(duì)對(duì)實(shí)際際應(yīng)用用而言言，其其遺傳傳特性性并非非最佳佳，需要要對(duì)細(xì)細(xì)胞代代謝途途徑進(jìn)進(jìn)行修修飾；；B、代謝謝控制制發(fā)酵酵（metaboliccontrolfermentetion）——是指利利用遺遺傳學(xué)學(xué)或生生物化化學(xué)方方法，，人為地在在DNA分子水水平上上改變變和控控制微微生物物的代謝謝，使使目的的產(chǎn)物物大量量的生生成、、積累累的發(fā)酵；；C、在代代謝控控制發(fā)發(fā)酵的的理論論基礎(chǔ)上上，提提出和形成成了““代謝謝工程程”概概念；；D、代謝謝工程程（也稱稱途徑徑工程程，pathwayengineering）——是指應(yīng)應(yīng)用重重組DNA技術(shù)和和分析析生物物學(xué)相相關(guān)的的遺傳學(xué)學(xué)手段段進(jìn)行行有精精確目目標(biāo)的的遺傳傳操作作，改改變酶酶的功能能和輸輸送體體系的的功能能，甚甚至改改變產(chǎn)產(chǎn)能系系統(tǒng)的的功能，，以改改變細(xì)細(xì)胞某某些方方面代代謝活活性的的整套套工作作（包括括代謝謝分析析、代代謝設(shè)設(shè)計(jì)、、遺傳傳操作作和目目的代代謝活性性的實(shí)實(shí)現(xiàn)））；即即是指指生物物化學(xué)學(xué)反應(yīng)應(yīng)代謝謝網(wǎng)絡(luò)絡(luò)有目的的地被被修飾飾。4．6．2基本原原理A、代謝謝網(wǎng)絡(luò)絡(luò)理論論細(xì)胞代代謝網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)由由上萬(wàn)萬(wàn)種酶酶催化化的系系列反反應(yīng)系系統(tǒng)、膜膜傳遞遞系統(tǒng)統(tǒng)、信信號(hào)傳傳遞系系統(tǒng)組組成，，并且且既受受精密調(diào)節(jié)，，又互相協(xié)協(xié)調(diào)；代謝網(wǎng)絡(luò)分分泌處的代代謝產(chǎn)物稱稱為節(jié)點(diǎn)。。根據(jù)可變程度節(jié)節(jié)點(diǎn)可分：：柔性節(jié)點(diǎn)點(diǎn)、剛性節(jié)節(jié)點(diǎn)和半柔柔性節(jié)點(diǎn)；柔性和半柔柔性節(jié)點(diǎn)是是代謝工程程設(shè)計(jì)的主主要對(duì)象，節(jié)點(diǎn)剛剛性程度在在改選前要要進(jìn)行分析析判斷；生物合成相相關(guān)代謝調(diào)調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)節(jié)網(wǎng)絡(luò)理論論代謝工程代代謝流及及節(jié)點(diǎn)分析析理論涉及碳碳源、呼呼吸系統(tǒng)和和氧化還原原重新設(shè)計(jì)計(jì)主要內(nèi)容中中心代謝產(chǎn)產(chǎn)物作用機(jī)機(jī)制及相關(guān)關(guān)代謝分析析B、代謝流及及中間產(chǎn)物物分析——靜態(tài)分析C、代謝控制制分析——?jiǎng)討B(tài)分析4．6．3代謝調(diào)節(jié)的的基本類型型及其機(jī)制制A、代謝調(diào)節(jié)節(jié)的基本類類型直線式代謝謝的反饋控控制協(xié)作式多價(jià)價(jià)反饋控制制合作反饋控控制累積反饋控控制順序反饋控控制同工酶控制制B、酶合成及及酶活性的的調(diào)節(jié)機(jī)制制末端代謝產(chǎn)產(chǎn)物阻遏酶的阻遏酶酶合成的分分解代謝物物阻遏和酶的誘導(dǎo)導(dǎo)酶酶的誘導(dǎo)導(dǎo)與合成變變構(gòu)酶活性的調(diào)調(diào)節(jié)同同工多功能酶4．6．4代謝工程的的研究方法法A、設(shè)計(jì)思路路改變代謝謝流擴(kuò)展代謝途途徑和構(gòu)建建新的代謝謝途徑常規(guī)方法——分子生物、、生化、物物化代謝通量分分析（MFA）—靜態(tài)B、研究代謝控制分分析（MCA）—?jiǎng)討B(tài)方法代謝網(wǎng)絡(luò)生生化系統(tǒng)理理論（BST）—最優(yōu)化原理理定量分析控控制論模型型（CM）—非線性途徑分析——途徑定位細(xì)胞代謝模模型C、代謝模型型的發(fā)展與優(yōu)化化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算生物學(xué)學(xué)方法遺傳算法D、逆代謝工工程4．7動(dòng)物細(xì)胞工工程產(chǎn)品制制備及質(zhì)控控4．7．1動(dòng)物細(xì)胞工工程產(chǎn)品制制備A、初級(jí)分離離——離心、過(guò)濾濾、吸附B、純化——色譜法C、制劑與冷冷凍干燥4．7．2動(dòng)物細(xì)胞工工程產(chǎn)品的的質(zhì)量控制制PAGE純度SDS液相色譜A、物化指標(biāo)標(biāo)測(cè)定含含量B、安全性評(píng)評(píng)介分分子量C、穩(wěn)定性4．8動(dòng)物細(xì)胞工工程表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)品的應(yīng)用用4．8．1重組蛋白藥藥物A、組織型纖纖溶酶原活活化劑（t-PA）突變體Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗梗死病人溶溶栓治療，，人t-PA基因位于8號(hào)染色體p12-q11.2，全長(zhǎng)36594bp，14個(gè)外顯子，，13個(gè)內(nèi)含子，，t-PA由527個(gè)氨基酸，，單鏈糖蛋蛋白，開始始酵母表達(dá)，，不能分離離純化t-PA突變體，由由雙鏈糖蛋蛋白，現(xiàn)用CHO細(xì)胞高效表表達(dá)成功（（參見下圖圖）B、β-干擾素（IFN-ββ）最早，為一一種在同種種細(xì)胞上具具有廣譜抗抗病毒活性的蛋蛋白質(zhì)，普普遍存在于于個(gè)體脾、、肝、腎、淋巴細(xì)細(xì)胞、骨髓髓，被多因因素誘發(fā)，，現(xiàn)為一組多功能能細(xì)胞因子子，具有抗抗病毒、腫腫瘤活性，調(diào)節(jié)免免疫反應(yīng)，，控制細(xì)胞胞生長(zhǎng)與分分化，天然IFN-ββ——刺激體外培培養(yǎng)人成纖纖維細(xì)胞，，大腸桿菌表表達(dá)，活性性低，不穩(wěn)穩(wěn)定，Cys17形成二硫鍵鍵，缺少N-Met，無(wú)糖基化化重組IFN-ββ點(diǎn)突變改造造，使Cys17變?yōu)橹行园卑被?，如：絲、酪酪氨酸，商商品名為：：IFN-ββ-1bCHO細(xì)胞表達(dá)，，與天然一一樣，天然然糖基化，，分離簡(jiǎn)單。。C、新型紅細(xì)細(xì)胞生成刺刺激蛋白（（NESP）D、血友病——缺少凝血因因子Ⅶ（FⅦ）或含量過(guò)過(guò)低疾病4．8．2MAb藥物（參見見下圖）——因?yàn)轶w內(nèi)同同一抗原具具多個(gè)表位位，刺激機(jī)體產(chǎn)生生不同抗體體（多克隆隆抗體）雜交瘤技術(shù)術(shù)能將多克克隆抗體純純化為具有高度均一一性，抗原原識(shí)別專一一性的MAb，降低抗原識(shí)識(shí)別交叉反反應(yīng)；4．8．3基因工程與與亞單位疫疫苗A、乙肝疫苗苗（參見下下圖）衣殼——衣殼表面抗抗原（HBsAg），核心抗原——核心抗原（（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸第一代疫苗苗，血中提提取，弱反反應(yīng)，10%不產(chǎn)生反應(yīng)應(yīng)，81-82年，美法，，85年，中國(guó)第二代疫苗苗，在哺乳乳細(xì)胞或CHO細(xì)胞表達(dá)，，81年，法美，91、92年，中國(guó)第三代疫苗苗，PreS抗原（重要要作用），，CHO細(xì)胞表達(dá)B、艾滋病疫疫苗（參見見下圖）CHO表達(dá)疫苗——理論上，有有致瘤性昆蟲細(xì)胞表表達(dá)疫苗——昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表表達(dá)系統(tǒng)（安全性好好，容量大大，表達(dá)效效率高）C、腫瘤疫苗苗滅活自體腫腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子子基因修飾飾，主動(dòng)加加強(qiáng)疫苗免免疫原性免疫同同種種異體的腫腫瘤細(xì)胞樹突狀細(xì)胞胞（抗原提提呈細(xì)胞））體內(nèi)外誘導(dǎo)導(dǎo)CTL生成（細(xì)胞毒性性T淋巴細(xì)胞））激發(fā)特異性性抗腫瘤免免疫功能（注射用曲曲妥珠單抗抗，原產(chǎn)地地英文商品品名:赫賽?。╖evalin澤娃靈是世世界上第一一個(gè)放射性性標(biāo)記的單單克隆抗體體，2002年在美國(guó)上上市，被批批準(zhǔn)用于難難治復(fù)發(fā)B細(xì)胞非霍奇奇金淋巴瘤瘤的治療。。）4．8．4基因治療產(chǎn)產(chǎn)品基因治療（（genetherapy）——是指把外界界的正?；蛞蚧蛑委熁蛲ㄟ^(guò)載載體轉(zhuǎn)入特特定靶細(xì)胞，以最最終預(yù)防或或改變特殊殊疾病狀態(tài)態(tài)的治療方法?；虻霓D(zhuǎn)移移可通過(guò)物物理或化學(xué)學(xué)的方法，也可通通過(guò)各種病病毒或非病病毒載體的的介導(dǎo)，還可通過(guò)改改造細(xì)胞（（造血干細(xì)細(xì)胞、成纖纖維細(xì)胞、骨髓肌肌細(xì)胞、肝肝細(xì)胞、神神經(jīng)細(xì)胞））進(jìn)行細(xì)胞治療。。A、神經(jīng)系統(tǒng)統(tǒng)疾病的基基因或細(xì)胞胞治療：B、造血干干細(xì)胞治治療癌癥癥HSC基因（參參見下圖圖）胰島素