微生物遺傳學(xué)-工業(yè)微生物學(xué)課件-08PPT幻燈片

遺傳（heredity

）:

上一代生物將自身的一整套遺傳基因穩(wěn)定地傳遞給下一代的特性。變異（variation）：

生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下，發(fā)生遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，而且這種改變穩(wěn)定，具有可遺傳性。引言1.遺傳與變異遺傳保證了微生物種的相對穩(wěn)定性、種的存在和延續(xù)，而變異則推動了種的進(jìn)化和發(fā)展。2.遺傳型和表型遺傳型（genotype）表型(phenotype)某一生物體個體所含有的全部遺傳因子，即基因的總和

，又稱為基因型。某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和。

表型的實現(xiàn)是由生物體的遺傳型和環(huán)境條件共同作用的結(jié)果。飾變（modification）

表型的差異只與環(huán)境有關(guān)。不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型改變。

谷氨酸發(fā)酵的溫度敏感菌株在30℃時菌體生長而不產(chǎn)生氨基酸，但是當(dāng)溫度提高到37℃時，菌體大量合成谷氨酸。變異遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變

3.飾變與變異（遺傳型變異,基因突變）特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為

（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）特點：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典實驗二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在部位和方式經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗:

證明DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。Avery在四十年代以更精密的實驗設(shè)計重復(fù)了以上實驗分別用S型菌中提取的DNA、RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化R型菌且DNA被酶降解破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化活性DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子一、三個經(jīng)典實驗T2噬菌體感染實驗2.噬菌體感染實驗（1952年，A.D.Hershey和M.Chase）3.植物病毒的重建實驗證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來自TMV還是HRV,可用血清學(xué)反應(yīng)鑒定證明核酸（RNA）是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)血清學(xué)反應(yīng)說明病毒蛋白質(zhì)的特性由核酸而定H.Fraenkel-Conrat(1956年)病斑的特性和病毒核酸一致二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式（一）七個水平細(xì)胞水平（單核，多核）細(xì)胞核水平（真核，擬核）染色體水平核酸水平（DNA，部分病毒為RNA；雙鏈，少數(shù)病毒為單鏈）基因水平（遺傳功能單位）密碼子水平（遺傳信息單位）核苷酸水平（最低突變單位和交換單位）周德慶p192-197;自學(xué)（一套，兩套,核外染色體）基因（gene）是什么?

是實體，其物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

（或RNA）；

是一個含有特定遺傳信息的DNA分子區(qū)段；

是遺傳信息傳遞和性狀分化發(fā)育的依據(jù)；

基因是可分的，根據(jù)功能不同，分為：編碼蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)基因（結(jié)構(gòu)蛋白，酶）調(diào)節(jié)基因（阻遏蛋白或激活蛋白）無翻譯產(chǎn)物的基因tRNA基因（簡稱tDNA

）

rRNA基因（簡稱rDNA

）

不轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段啟動子（promotor）操縱基因（operator）基因是一個含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳的功能單位。第二節(jié)質(zhì)粒P196質(zhì)粒（plasmid）一種獨立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。附加體(episome)指哪些既可以整合到核染色體上，作為染色體的一部分而進(jìn)行復(fù)制，又可以再游離出來或攜帶一些寄主的染色體基因游離出來，這類質(zhì)粒被稱為附加體。

1、質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)(1)結(jié)構(gòu)通常以共價閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）2.質(zhì)粒的分離堿提取法：①菌體的培養(yǎng)和收集：一般采用豐富培養(yǎng)基對菌體進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到指數(shù)期后期時，離心收集細(xì)胞。②溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。③堿變性處理：在SDS等表面活性劑存在下加NaOH液使pH升至12.4，可使菌體蛋白質(zhì)、染色體DNA以及質(zhì)粒DNA變性。④質(zhì)粒復(fù)性：加入pH4.8的KAc-HAc緩沖液，將提取液調(diào)至中性，由于質(zhì)粒分子量小而容易復(fù)性，并穩(wěn)定存在于溶液中；染色體DNA分子量太大，在復(fù)性過程中形成DNA之間的交聯(lián)導(dǎo)致其形成更大分子的不溶性物質(zhì)。⑤離心分離：經(jīng)高速離心可以使細(xì)胞碎片和已變性的菌體蛋白及染色體DNA一起沉淀，上清液中主要是質(zhì)粒DNA，經(jīng)乙醇沉淀后，可獲得質(zhì)粒DNA。（參見P197）3.質(zhì)粒的檢測提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；氯化銫-溴化乙啶密度梯度超速離心；

對于實驗室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點，如抗藥性初步判斷。對于由于三種構(gòu)型同時存在時造成的多帶現(xiàn)象（提取質(zhì)粒時造成或自然存在），可以進(jìn)行特異性單酶切，使其成為一條帶。

瓊脂糖凝膠電泳后觀察；4.質(zhì)粒的特性(1)位于核基因組外；(3)自主復(fù)制；(2)cccDNA鏈霉菌和酵母菌中發(fā)現(xiàn)了線狀dsDNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒(4)有的質(zhì)?？烧系胶巳旧w上；(5)可重組（質(zhì)粒與質(zhì)粒間，質(zhì)粒與染色體間）；(6)人為消除（丫叮類，UV，電離輻射，利福平等）(7)有的質(zhì)粒可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移（F因子，R因子）質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；有時能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢5、質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分類:致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性質(zhì)粒（Resistancefactor，R因子）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）2μm質(zhì)粒（參見P197）(1)致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌性）。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體(episome)。在志賀氏菌屬（Shigella）、沙門氏菌屬（Salmonella）和鏈球菌屬（Streptococcus）等其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌類似的致育因子。在放線菌中，天藍(lán)色鏈霉菌含有SCP1和SCP2兩種致育質(zhì)粒，這兩種質(zhì)粒在天藍(lán)色鏈霉菌的接合過程中起重要作用，帶動染色體從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。（參見P197）(2)抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）四環(huán)素（tetracycline，tet）鏈霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸（fusidicacid，fus）負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。(3)Col質(zhì)粒：產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，因此，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素：許多細(xì)菌都能產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物，抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株，因為這些代謝產(chǎn)物是由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜，所以稱為細(xì)菌素（bacteriiocin）細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。此外還有枯草桿菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強烈抑制某些G+細(xì)菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。大腸桿菌素是產(chǎn)自大腸桿菌的一種蛋白質(zhì)，具有專一性地殺死其親緣關(guān)系很近的、不具Col質(zhì)粒的其它腸道細(xì)菌的功能。(4)毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子(5)

代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）

質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。將復(fù)雜的有機化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟腦等的能力。降解質(zhì)粒TOL質(zhì)粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCT質(zhì)粒：含分解樟腦辛烷的基因(6)隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。(7)2μm質(zhì)粒

大多數(shù)酵母菌含有一種稱為2μm的質(zhì)粒

,屬隱秘質(zhì)粒意義：2μm質(zhì)粒是酵母菌中進(jìn)行分子克隆和基因工程的重要載體，因此以它為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆和表達(dá)載體已得到廣泛的應(yīng)用。另一方面，該質(zhì)粒也是研究真核基因調(diào)控和染色體復(fù)制的一個十分有用的模型

-長為2m的6kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子-位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，50~100拷貝-只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個基因，無遺傳表型-質(zhì)粒上有兩個600bp長的IR，被一個2.7kb區(qū)域和一個2.3kb小區(qū)域所間隔-兩個IR上都有一個專一重組位點(FRT)，經(jīng)過重組，可使質(zhì)?；プ儺悩?gòu)成A型和B型。根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點，質(zhì)?？煞譃椋焊呖截悢?shù)(highcopynumber)質(zhì)粒（每個細(xì)胞中可以有10~100個拷貝,其復(fù)制和染色體的復(fù)制不同步）如ColE1、ColE2等

———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒（每個細(xì)胞中只有1~2個拷貝,其復(fù)制行為與染色體的復(fù)制同步）如F因子，R100

———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）第三節(jié)基因突變的規(guī)律及類型野生型:

------從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株（wildtypestrain），簡稱野生型。突變株:

-----野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱為突變株（mutant）。一、突變（mutation）突變指細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生變化的現(xiàn)象。包括基因突變（又稱點突變）和染色體畸變。基因突變（genemutation）:是指一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變，涉及一對或少數(shù)幾對堿基的置換、缺失或插入，因其發(fā)生的范圍很小，所以又稱點突變（pointmutation）。染色體畸變（chromosomalaberration）:是指染色體較大范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)的變化，如缺失、重復(fù)、倒位、易位等以及染色體數(shù)目的變化。同種堿基的置換不同種堿基的置換只涉及1對堿基被另1對堿基所置換1個或少數(shù)幾個堿基對的插入或缺失，使該部位后面遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的突變。遺傳物質(zhì)在染色體水平發(fā)生較大范圍的變化DNA分子中1對或少數(shù)幾對堿基的突變微生物遺傳學(xué)的幾個基本概念核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典實驗原理質(zhì)粒、質(zhì)粒分離及質(zhì)粒分類舉例基因及其突變的基本定義二、基因突變的特點（規(guī)律）（參見P199）自發(fā)性菌種衰退的根本原因不對應(yīng)性突變的性狀與突變的原因無關(guān)系稀有性自發(fā)突變幾率低（10-6~10-10）突變率：每一個細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。（某一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目）獨立性某基因的突變率不受它種基因突變率的影響可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑的影響而提高（10-3~10-6）穩(wěn)定性基因突變后的新性狀是穩(wěn)定的可逆性野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變，也可發(fā)生反向的回復(fù)突變。證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系！如何證明基因突變的非對應(yīng)性？三個經(jīng)典實驗:1.變量實驗、2.涂布實驗、3.影印實驗三、基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的實驗證明1）變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuria&MaxDelbruck(1943)對噬菌體T1敏感的E.coli對數(shù)期培養(yǎng)物，稀釋至103/mL,分裝兩試管，各10mL

與甲管分裝的各小管同時保溫24~36h甲管乙管2）Newcombe的涂布實驗（1949）在涂布過的一組中，共長出抗性菌落353個，比未經(jīng)涂布過的（28個菌落）高得多約繁殖了12.3代選用對T1噬菌體敏感的E.coli，以相等數(shù)目涂布于12個平板上3）影印實驗（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）通過使菌不接觸抗性環(huán)境而檢查其抗性菌落的方法

營養(yǎng)缺陷型抗性突變型條件致死突變型

形態(tài)突變型抗原突變型產(chǎn)量突變型下面介紹幾種常用的突變型及其分離1.

按照突變的表型分類：選擇性突變株（能在選擇性培養(yǎng)基上或其它的選擇性條件下迅速選出或鑒別出）非選擇性突變株四、基因突變的類型（1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）一種缺乏合成其生存所必須的營養(yǎng)物（包括氨基酸、維生素、堿基等）的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能生長。營養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長特點：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長負(fù)選擇標(biāo)記突變株不能通過選擇平板直接獲得營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。（2）抗藥性突變型（resistantmutant）基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示strr和strs分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性（3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）203

在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts（temperaturesensitive）表示，這類突變在高溫下（如42℃）是致死的，但可以在低溫（如25-30℃）下得到這種突變。特點：負(fù)選擇標(biāo)記這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因（4）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）造成形態(tài)改變的突變型特點：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。舉例：產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開。形成芽孢缺陷菌株（5）抗原突變型指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，包括細(xì)胞壁缺陷變異、莢膜或鞭毛成分變異等。（6）產(chǎn)量突變型通過基因突變而引起的目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生變化的變異菌株，其在產(chǎn)量上高于或低于原始出發(fā)菌株。如果產(chǎn)量提高的突變株，被稱為“正突變”（plus-mutant），也稱為“高產(chǎn)突變株”(highproducingmutant)；如果產(chǎn)量低于出發(fā)菌株的突變株，則稱為“負(fù)突變”（minus-mutant）。2.按照突變所引起的遺傳信息的改變情況可分為三種：同義突變表型不發(fā)生改變（密碼子是簡并的,如CGU變成CGC，但都編碼精氨酸）；錯義突變改變的密碼子編碼的氨基酸改變了；無意義突變終止密碼子（UAA,UAG,UGA）其它突變類型

毒力、生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵能力的變化等在實際應(yīng)用中具有重要意義突變類型,一般都不具有很明顯或可直接檢測到的表型。其突變株的獲得往往需要較大的工作量。

第四節(jié)基因突變的機制一、基因突變的分子基礎(chǔ)(一)自發(fā)突變

(二)誘發(fā)突變引起自發(fā)突變的原因主要有以下幾方面：

背景輻射和環(huán)境因素引起；有害代謝產(chǎn)物引起；互變異構(gòu)效應(yīng)引起的堿基配對錯誤；

DNA復(fù)制過程中堿基配對錯誤；轉(zhuǎn)座因子的作用。通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高自發(fā)突變頻率的手段。生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變（10-6-10-9）。它是生物進(jìn)化的根源。(二)、誘發(fā)突變誘變劑（mutagen）：凡能提高基因突變頻率的因素統(tǒng)稱為誘變劑誘變劑的種類物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑堿基類似物誘變劑；與堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑；嵌入誘變劑；

：輻射和熱：轉(zhuǎn)座因子(1)堿基類似物----間接引起置換的誘變劑它們在DNA復(fù)制中能摻入DNA分子中，由于其產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，因此發(fā)生的錯誤配對可引起堿基的置換。一類與正常堿基結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，稱為堿基類似物。如：5-BU,8-NG,2-AP等。A-TA-TA-BUA-TG-BUG-CA-BU加入5-BU1.化學(xué)誘變劑(2)與堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑-----直接引起堿基置換該類誘變劑與堿基起化學(xué)反應(yīng)，改變堿基的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致錯配。亞硝酸：G-CA-T轉(zhuǎn)換互變各種烷化劑：G-CA-T互變羥胺：只引起G-CA-T轉(zhuǎn)換（專一性與C起反應(yīng)）亞硝酸：對堿基的主要作用是氧化脫胺作用（使氨基變?yōu)橥淖兣鋵π再|(zhì)，引起堿基轉(zhuǎn)換）。

HNO2

AH（次黃嘌呤）ATGCCUGCATGX（黃嘌呤）不引起突變A-TH-TH-CA-TH-CG-C烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（MMS）硫酸二乙酯（DES）N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍

(NTG)

氮芥、硫芥環(huán)氧乙烷NTG：誘變作用強，稱為超強誘變劑（突變率1%）；能誘發(fā)鄰近位置的基因同時發(fā)生突變，即所謂并發(fā)突變。很多烷化劑除了能誘發(fā)點突變外，還能誘發(fā)染色體畸變。由于染色體畸變常為輻射所誘發(fā)，所以這些物質(zhì)又稱為擬輻射物質(zhì)。烷化劑作用的主要機理是引起堿基上某些能形成氫鍵的集團(tuán)發(fā)生烷基化。烷化位點主要在鳥嘌呤的N‐7位和腺嘌呤的N‐3位上，烷化后的堿基也像堿基結(jié)構(gòu)類似物一樣能引起堿基配對的錯誤。烷化劑的另一作用是使嘌呤整個地從DNA鏈上脫下來，產(chǎn)生一個缺口，在與缺口相對應(yīng)的位點上就能配上任何一個堿基，從而引起轉(zhuǎn)換或顛換。(3)移碼突變的誘變劑－嵌入誘變劑吖啶類染料（如原黃素，吖叮黃（橙），ICR類等）具有類似堿基對的扁平結(jié)構(gòu)，能插入DNA分子的堿基對之間，使DNA結(jié)構(gòu)變形，導(dǎo)致DNA在復(fù)制過程中的滑動，引起DNA鏈中插入或缺失一個或幾個核苷酸，產(chǎn)生移碼突變。ICR：一系列烷化劑和吖啶分子相結(jié)合的化合物2.物理誘變劑及其誘變機制紫外線，x-射線，γ–射線，快中子，超聲波等(1)紫外線（UV）紫外線是實驗室中常用的非電離輻射誘變因子，其作用機制主要是能引起：DNA鏈的斷裂、DNA分子雙鏈的交聯(lián)、嘧啶的水合作用相鄰堿基形成嘧啶二聚體（TT，TC,CC）等。

其中最主要的效應(yīng)是胸腺嘧啶二聚體的形成。胸腺嘧啶二聚體通常出現(xiàn)在同一DNA單鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶之間，也可出現(xiàn)在兩條DNA單鏈之間。兩種情況導(dǎo)致結(jié)果不同。X‐射線、γ‐射線、快中子等屬于電離輻射。以X‐射線為例解釋該類誘變劑誘變機理：X‐射線的誘變作用有直接和間接兩種方式：

(1)直接作用是引起DNA雙鏈間氫鍵的斷裂、DNA單鏈的斷裂、不同DNA分子之間的交聯(lián)等。

(2)間接作用是電離輻射能從水或有機分子中產(chǎn)生自由基，這些自由基作用于DNA分子，引起缺失和損傷。自由基對嘧啶的作用更強烈。此外，X射線還可能使細(xì)胞中形成一些堿基類似物，突變由這些堿基類似物所誘發(fā)。與紫外線不同的是，電離輻射可通過玻璃和其他物質(zhì)，穿透力強，能達(dá)到生殖細(xì)胞，因此常用于動植物的誘變育種。(2)X‐射線、γ‐射線、快中子短時間的熱處理也可誘發(fā)突變，熱的作用是使胞嘧啶脫氨基而成為尿嘧啶，從而通過堿基配對錯誤而引起GC→AT的轉(zhuǎn)換；另外，熱也可引起鳥嘌呤‐脫氧核糖鍵的移動，從而在DNA復(fù)制時出現(xiàn)包括兩個鳥嘌呤的堿基對，在下一次的DNA復(fù)制中該堿基對錯配就會引起GC→CG的顛換。(3)熱(1).轉(zhuǎn)座因子（transposableelement)定義：位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列。廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中。又稱“跳躍基因”(2).轉(zhuǎn)座因子的特點1)在轉(zhuǎn)座時，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上；

2)都攜帶有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶具有轉(zhuǎn)移位置的功能，是轉(zhuǎn)座所必需的;3)兩端都有正向或反向末端重復(fù)序列。

3.生物誘變劑(轉(zhuǎn)座因子)及其誘變機制(3)根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和遺傳性質(zhì)，轉(zhuǎn)座因子可分為3類：插入序列（Insertionsequence,IS）僅含有編碼轉(zhuǎn)座所必需的轉(zhuǎn)座酶的基因，兩端存在9～41bp的反向重復(fù)序列

。但其插入可干擾基因的正常讀碼序列，導(dǎo)致基因失活或引起突變。轉(zhuǎn)座子（Transposon,Tn）除轉(zhuǎn)座基因外，還有抗藥性基因。分為復(fù)合轉(zhuǎn)座子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子Mu噬菌體是以大腸桿菌為宿主的溫和性噬菌體。它在幾方面不同于另一種溫和噬菌體λ：第一、MuDNA幾乎可以插入到宿主染色體的任何一個位點上；第二、DNA兩端沒有粘性末端；第三、會引起宿主的被插入基因的基因突變。

(4)轉(zhuǎn)座的過程：插入突變

(基因失活和極性作用)染色體畸變(染色體的缺失\重復(fù)和倒位)

(5)轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)：二、誘變及化學(xué)致癌物質(zhì)的檢測——Ames試驗“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：

人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。Ames試驗的依據(jù)誘變劑的共性原則：

化學(xué)藥劑對細(xì)菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比?；貜?fù)突變(reversemutation或backmutation)：

突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變。美國加利福尼亞大學(xué)的BruceAmes教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗標(biāo)準(zhǔn)菌株要求：

檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率（為了增加試驗的敏感性，該菌株還應(yīng)包括另外兩個突變，一個是造成細(xì)胞表面透性增加的深度粗糙突變型，另一個是喪失切除修復(fù)能力的缺失型）。Ames試驗斑點試驗和平板摻入試驗

方法步驟1．菌株鑒定用于測試的菌株，需經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀鑒定，符合要求才能投入使用。菌種：TA97、TA98、TA100和TA102

鑒定項目：（1）脂多糖屏障丟失

（2）R因子

（3）紫外線損傷修復(fù)缺陷

（4）自發(fā)回變（5）回變特性——診斷性試驗應(yīng)用：

1．斑點試驗只局限于能在瓊脂上擴散的化學(xué)物質(zhì)，大多數(shù)多環(huán)芳烴和難溶于水的化學(xué)物質(zhì)均不適宜用此法。此法敏感性較差，主要是一種定性試驗，適用于快速篩選大量受試化合物。

2．平板摻入試驗可定量測試樣品致突變性的強弱。此法較斑點試驗敏感，獲陽性結(jié)果所需的劑量較低。點試獲陽性結(jié)果的濃度用于摻入試驗（每皿0.1ml），往往出現(xiàn)抑（殺）菌作用。

3．致變作用遲緩或有抑菌作用的試樣，培養(yǎng)時間延長至72h。

4．揮發(fā)性的液體和氣體試樣，可用干燥器內(nèi)試驗法進(jìn)行測試。

5．目前，Ames試驗作為檢測環(huán)境誘變劑的一組試驗中的首選試驗，廣泛應(yīng)用于致突變化學(xué)物的初篩。但是，與今天快信息、高效率的社會要求相比，該試驗程序還嫌繁瑣，方法不夠簡便，有待于創(chuàng)建新的更為快速靈敏、簡單易行的環(huán)境誘變劑短期生物測試法。用途：廣泛用于檢測環(huán)境和食品中是否存在化學(xué)致癌物。特點：快速、準(zhǔn)確、費用廉價三、DNA損傷的修復(fù)

除了DNA聚合酶進(jìn)行校正外，還通過幾種不同的機制進(jìn)行DNA的修復(fù)：(1)光復(fù)活作用(2)切除修復(fù)(3)重組修復(fù)(4)SOS修復(fù)紫外線誘變時必須在暗室、紅光下進(jìn)行（1）光復(fù)活作用（photoreactivation）可見光可大大降低經(jīng)紫外線照射后微生物死亡率的現(xiàn)象。機理：經(jīng)UV照射后帶有嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中會和一種光激活酶——光解酶結(jié)合，形成酶‐DNA復(fù)合物，該復(fù)合物暴露在可見光下時，光解酶會因獲得光能而被激活，并使二聚體重新分解成單體，光解酶也從復(fù)合物中釋放出來，再結(jié)合到其它二聚體上。

這種修復(fù)機制不是移去和取代核苷酸，而是胸腺嘧啶二聚體直接被修復(fù)，所以是一種無錯誤的修復(fù)。（2）切除修復(fù)（excisionrepair，又稱暗修復(fù)）一種普遍的修復(fù)系統(tǒng)。能移去胸腺嘧啶二聚體和修復(fù)大多數(shù)引起的DNA扭曲損傷。該修復(fù)系統(tǒng)不需要可見光，通過酶切作用移去損傷的堿基（包括損傷位點附近的一些堿基），隨后合成一段正常DNA鏈。

內(nèi)切核酸酶

4種酶參與外切核酸酶

DNA聚合酶DNA連接酶（3）重組修復(fù)這是一種越過損傷而進(jìn)行的修復(fù)。這種修復(fù)不將損傷的堿基除去，而是通過復(fù)制后，經(jīng)染色體交換，使子鏈上的空隙部位不再面對著嘧啶二聚體，而是面對著正常的單鏈，在這種情況下，DNA聚合酶和連接酶便能起作用，把空隙部分進(jìn)行修復(fù)。留在親鏈上的二聚體仍要依靠再一次的切除修復(fù)加以除去，或經(jīng)細(xì)胞分裂而稀釋掉。(4)SOS修復(fù)這是在DNA分子受到較大范圍的重大損傷時誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)急反應(yīng)。涉及幾個基因：recA、lexA、uvrA、uvrB、uvrC的共同作用。此外，經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌還可能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種稱為錯誤傾向（error-prone）的DNA聚合酶，催化空缺部位的DNA修復(fù)合成，但由于它們識別堿基的精確度低，所以容易造成復(fù)制的差錯，這是一種以提高突變率來換取生命存活的修復(fù)，又稱錯誤傾向的SOS修復(fù)。第五節(jié)微生物的誘變育種一、誘變育種中的幾個原則

指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。2個主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時，使存活個體中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。（一）出發(fā)菌株（originalstrain）出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等）；對誘變劑敏感野生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：出發(fā)菌株的來源：（二）菌懸液的制備1.選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：①使每個細(xì)胞能均勻接觸誘變劑；

②減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）2.同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）3.菌齡：對誘變劑最敏感時期

營養(yǎng)細(xì)胞：對數(shù)期孢子或芽孢：萌發(fā)前期4.菌懸液的制備方法

物理誘變：生理鹽水配制化學(xué)誘變：緩沖液配制5.菌懸液的濃度

酵母菌，霉菌的孢子：106個/mL

細(xì)菌，放線菌孢子：108個/mL

（三）誘變劑的選擇及處理方法1.誘變劑的選擇（高效，簡便）物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡便；

化學(xué)誘變劑：頻度高，點突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。(NTG——超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑2.劑量的選擇突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量,反而會使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對殺菌率為70~75%,甚至30~70%的劑量。UV的劑量:固定UV功率和照射距離,以照射時間長短來確定劑量多少。最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動的劑量。常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）3.誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理：①同一誘變劑的重復(fù)使用；②兩種或多種誘變劑的先后使用；③兩種或多種誘變劑的同時使用.（四）中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.

分離性延遲：

突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。

生理性延遲：

由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。分離性延遲的原因:對數(shù)生長期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對數(shù)期的細(xì)胞時，突變通常發(fā)生在一個核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因:當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時,由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。生理性延遲:（五）突變株的篩選

初篩復(fù)篩1.初篩（以量為主）（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）2.復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測定）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測所需產(chǎn)物方法需簡便、快速2步誘變育種的基本原則：選擇簡便有效的誘變劑；挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；處理單細(xì)胞或單孢子懸液；選用最適的誘變劑量；充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)；利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)；設(shè)計高效篩選方案；創(chuàng)造新型篩選方法。二、幾種重要突變株的篩選方法1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選(2)抗藥性突變株篩選2.營養(yǎng)缺陷型的篩選

1.抗性突變株的篩選

（1）抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物的突變株

用途：篩選相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株（2）抗藥性突變株

用途：篩選相應(yīng)藥物(抗生素)的高產(chǎn)菌株或遺傳標(biāo)記制作

篩選的方法:

a.高于臨界濃度的平板進(jìn)行分離；

b.梯度平板法

敏感菌苔

抗性菌落加入含異煙肼的上層

加入不含異煙肼的底層

所謂結(jié)構(gòu)類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質(zhì)。如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達(dá)到定向培育吡哆醇高產(chǎn)突變株的目的。為什么在篩選突變株時,不能直接用代謝產(chǎn)物,而必須用其結(jié)構(gòu)類似物?2.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（1）幾個概念：三類培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM,minimalmedium）[-]：某野生型能生長的最低成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM,completemedium）[+]：各種營養(yǎng)缺陷型能生長的天然或半組合培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基（SM,supplementalmedium）[A]:[-]+A[B]:[-]+B相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型能生長的組合或半組合培養(yǎng)基三種遺傳型：野生型（wildtype）從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生長。營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。

[A+B-]：能在[+]、[B]生長[A-B+]：能在[+]、[A]生長[A-B-]：能在[+]生長原養(yǎng)型（prototroph）營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營養(yǎng)要求[A+B+],可在[-]生長（2）篩選步驟（5步）誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型①中間培養(yǎng)CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜?？朔硇脱舆t。②淘汰野生型即濃縮缺陷型，以提高檢出率方法

抗生素法（G+細(xì)菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）

菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）

饑餓培養(yǎng)（無N）MM6~12h2N培養(yǎng)(2N)MM1~2h加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜③營養(yǎng)缺陷型的檢出方法逐個檢出法夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法影印平板法④營養(yǎng)缺陷型的鑒定生長譜法：快速，直觀分兩步：a.三大類營養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基)具體操作:一般采用“濾紙片法”

a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液

b.維生素混合液

c.0.1%堿水解酵母核酸液abc三大類營養(yǎng)要求的鑒定：以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將18種氨基酸按右表分為6組特點：每2組只有一種共同物質(zhì)單一營養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定：組別化合物代號117891011227121314153381216171844913161920551014171921661115182021135246（3）營養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌(氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。

誘變育種的程序：實驗講義p175

出發(fā)菌株（純化）前培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)至對數(shù)期）

菌懸液制備活菌計數(shù)

誘變預(yù)備實驗（劑量存活率曲線）

誘變處理（相對殺菌率為70-75%，30-70%）活菌計數(shù)

中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜，克服表型延遲）

突變株分離

初篩

復(fù)篩

生產(chǎn)性能試驗菌種（鑒定與）保藏

1.從生產(chǎn)中選育

2.定向培育優(yōu)良品種一般指用特定因素長期處理微生物群體，同時不斷地對它們進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。

例：卡介苗（牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒活菌苗）三、自發(fā)突變與育種第六節(jié)原核生物的基因重組基因重組（generecombination）：將兩個不同性狀個體的基因通過一定的方式轉(zhuǎn)移到一起，并發(fā)生重新組合，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程，稱為基因重組(generecombination)或遺傳重組。

重組：遺傳物質(zhì)在分子水平上發(fā)生的交換；雜交：在細(xì)胞水平上遺傳物質(zhì)的交換.

雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。原核生物的基因重組類型

4種形式：1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）接合4）原生質(zhì)體融合一、

轉(zhuǎn)化（transformation）定義：受體細(xì)胞直接吸收供體細(xì)胞的DNA片段,并與其染色體同源片段進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。

目前已知有二十多個種的G+和G-細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力此過程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：具有攝取外源

DNA能力的細(xì)胞1.感受態(tài)感受態(tài)：是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。一個細(xì)菌能否出現(xiàn)感受態(tài)是由其遺傳性決定的，但受環(huán)境條件的影響也很大，因而表現(xiàn)差別很大。

感受態(tài)因子：調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白，它包括三種主要成分：膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶。

自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長階段的生理特性（如肺炎鏈球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對數(shù)生長期）受細(xì)菌自身的基因控制人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

（該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)！）進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：（1）建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞（2）外源游離DNA分子感受態(tài)的機理研究：局部原生質(zhì)體化假說：處于感受態(tài)的細(xì)胞局部失去了細(xì)胞壁，使外源DNA能順利經(jīng)膜進(jìn)入菌體。酶受體假說：受體細(xì)胞表面出現(xiàn)了一種能結(jié)合DNA并使之進(jìn)入細(xì)胞的酶。2.轉(zhuǎn)化模型（1）轉(zhuǎn)化因子

本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞前還會被酶解成更小的片段，約8kb。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA.

革蘭氏陰性的嗜血桿菌中，細(xì)胞只吸收dsDNA形式的轉(zhuǎn)化因子，但進(jìn)入細(xì)胞后需經(jīng)酶解為ssDNA，才能與受體菌的基因組整合；革蘭氏陽性的鏈球菌和芽孢桿菌中，dsDNA的一條鏈必須在胞外降解，只有ssDNA形式的轉(zhuǎn)化因子才能進(jìn)入細(xì)胞。

但不管何種情況，最易與細(xì)胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。由于每個細(xì)胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點有限（如肺炎鏈球菌約10個），因此，從外界加入無關(guān)的dsDNA就可競爭并干擾轉(zhuǎn)化作用。質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。

轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1％，最高為20％。(2)轉(zhuǎn)化過程供體(strR)dsDNA感受態(tài)受體(strS)酶解與吸收單鏈同源區(qū)段配對單鏈整合復(fù)制與分離轉(zhuǎn)化子(strR)非轉(zhuǎn)化子(strS)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化的主要過程轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞

轉(zhuǎn)化因子單鏈配對與整合

復(fù)制

分離

自然轉(zhuǎn)化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）

給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化形成轉(zhuǎn)化子效率要低得多；提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法：1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌-------重組獲救b）不需要活的DNA給體細(xì)胞；定義：噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒。4.轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入微生物細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。特點：5、人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，PEG介導(dǎo)、電穿孔、基因槍法等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段（使細(xì)胞膜更易于透過DNA）。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高（不像線型DNA那樣易于降解，而且還能在宿主中復(fù)制。任何來源的DNA將其連接到質(zhì)粒上都能進(jìn)入受體細(xì)胞）.二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）

攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。(1)意外的發(fā)現(xiàn)1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌LT22A(trp-)（P22）和LT2(his-)進(jìn)行實驗：用“U”型管進(jìn)行同樣的實驗時，在供體和受體細(xì)胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！沙門氏菌LT22A(trp-)是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌另一株LT2(his-)是非溶源性細(xì)菌一個表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致一個驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的(在接種LT22A的一端出現(xiàn)了原養(yǎng)型)（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn)）(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么“錯”將宿主的DNA包裹進(jìn)去?噬菌體的DNA包裝酶也能識別染色體DNA上類似pac的位點并進(jìn)行切割，“headful”的包裝機制包裝進(jìn)P22噬菌體外殼，形成只含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒（假噬菌體）。因為染色體上的pac與P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率較低，這種“錯裝”機率一般僅約10-6-10-8

形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的，也可以是烈性的，但必須具有能偶爾識別宿主DNA的包裝機制，并在宿主基因組完全降解以前進(jìn)行包裝。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。如果受體菌通過普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得了供體菌DNA片段后，在其體內(nèi)不發(fā)生基因的交換、整合和復(fù)制，只進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)被稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo).2.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）

定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。

媒介：

部分缺陷噬菌體（丟失自身一部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代）

只能轉(zhuǎn)導(dǎo)個別特定基因

大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過程低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）的定義:

誘導(dǎo)溶源性大腸桿菌而產(chǎn)生的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，除含有正常的噬菌體外，還有少數(shù)（10-6）轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒，因此，用誘導(dǎo)λ溶源性菌株得來的噬菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)時的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率不過10-6，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT):

如果細(xì)菌染色體中整合有一個正常的λ噬菌體時，缺陷λ噬菌體也能整合到同一細(xì)菌染色體上（因為正常λ噬菌體整合后，產(chǎn)生兩個細(xì)菌/噬菌體雜合att位點，缺陷λ噬菌體可以在該位點插入），這種細(xì)菌稱為雙重溶源菌.雙重溶源菌中，正常λ噬菌體稱為輔助噬菌體，因為它幫助缺陷噬菌體整合和繁殖。雙重溶原菌在紫外輻射等因子的誘導(dǎo)下,原噬菌體容易被切割下來，產(chǎn)生等量的缺陷噬菌體和正常噬菌體，該裂解物稱為高頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用這樣的裂解物去感染細(xì)菌，將比低頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物產(chǎn)生多得多的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。這一過程稱為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。大腸桿菌的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)比較：

uvE.coliK12(λ)LFT

裂解物

λ

λdg(10-5

~10-6)

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體

uvE.coliK12(λ/λdg)HFT裂解物

50%λ

(雙重溶源菌)

50%λdg轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體

低頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）：

LFT裂解物E.coligal-E.coligal-/λdgal+

（極少量轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落)E.coligal-

高頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT)：

HFT裂解物E.coligal-E.coligal-/λdgal+

（50%轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落)E.coligal-（50%）普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性比較普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生自然發(fā)生人工誘導(dǎo)（uv）噬菌體形成誤包前噬菌體的“誤切”內(nèi)含DNA只含宿主DNA含噬菌體和宿主DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)性狀供體的任何性狀前噬菌體兩端鄰近基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過程雙交換（轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA替換受體DNA同源區(qū)）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA插入，使受體菌為部分二倍體

溶源轉(zhuǎn)變（lysogenicconversion）：一個與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象定義:溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？a）噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；三、

接合(conjugation)通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程1.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細(xì)菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。證實接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）2.能進(jìn)行接合的微生物種類主要在細(xì)菌和放線菌中存在。在細(xì)菌中，G－細(xì)菌尤為普遍，如E.coli、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、固氮菌屬和假單胞菌屬等；放線菌中，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬最為常見，其中研究得最為詳細(xì)的是天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomycescoeilcolor）。在不同屬的一些菌種之間也可發(fā)生接合現(xiàn)象，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌間或沙門氏菌與痢疾志賀氏菌間。在所有對象中，接合現(xiàn)象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli

。E.coli

是有性別分化的，決定性別的是其中的F質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒還是合成性菌毛基因的載體。3.大腸桿菌的接合型與接合細(xì)菌遺傳重組單向過程和F因子的提出F－菌株F＋菌株

Hfr菌株F因子結(jié)構(gòu)圖:相對分子質(zhì)量通常為5×107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進(jìn)行的20多個基因。

圖中黃色區(qū)域表示轉(zhuǎn)座子，通過這些部位可以整合進(jìn)細(xì)菌染色體上形成各種Hfr菌株。Hfr菌株:細(xì)胞中的F質(zhì)粒整合到核染色體組上,與F－菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比任何已知的F＋與F－接合后的頻率高出幾百倍，這種“雄性”菌株稱為Hfr。在Hfr菌株與F-細(xì)胞進(jìn)行接合時,OriT序列被缺刻螺旋酶識別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞大多數(shù)仍然是F-（即不能使受體菌變成供體）。接合中DNA轉(zhuǎn)移過程有著穩(wěn)定的速度和嚴(yán)格的順序性。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時間就越早，頻率也高。中斷雜交（interruptedmating）技術(shù)和基因定位利用Hfr×F-的接合過程，在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。左圖:不同Hfr菌株的形成方式，以不同的起點不同的順序轉(zhuǎn)移基因。（a）細(xì)菌染色體為環(huán)狀，可以不同的IS位點打開，F(xiàn)質(zhì)粒插入進(jìn)去。（b）Hfr菌株的部分基因順序。大腸桿菌基因組很大（全部轉(zhuǎn)移需要100分鐘），其遺傳圖譜須用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成基因定位：通過遺傳重組等手段確定不同的基因在染色體上的位置及相對距離，從而獲得遺傳圖譜。連鎖的二基因間的距離與其共轉(zhuǎn)化，或共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率成反比，因此，可根據(jù)二個基因被共轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率判斷它們在染色體上的相對距離。

接合作用（中斷雜交）作圖只能判斷相距較遠(yuǎn)的基因間的相對位置；轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化則可用于對相隔很近的基因進(jìn)行定位；大腸桿菌遺傳圖譜目前對大腸桿菌的染色體已定位了1000多個基因F′菌株F′菌株:

Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞細(xì)胞基因通過F′和F-的接合而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的過程常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，或F因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediatedtransduction）。F′所帶的基因可以與染色體發(fā)生重組；也可以繼續(xù)存在于F′因子上。F質(zhì)粒的四種存在方式及相互關(guān)系接合(conjugation)：細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體介導(dǎo)自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞“接合”“轉(zhuǎn)導(dǎo)”及“自然轉(zhuǎn)化”這三種在自然界中存在的細(xì)菌遺傳重組過程各自的特點：a）外源DNA的來源及進(jìn)入途徑有差異；b）決定因素也各有不同；如何設(shè)計實驗對三種途徑進(jìn)行區(qū)分？四、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）1.定義：通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。

融合子（fusant）意義：打破了微生物的種界界限，可實現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會?？膳c其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中。

兩親本菌株的選擇和遺傳標(biāo)記的制作（選擇不同的營養(yǎng)缺陷型，

（A:[a+b-],B:[a-b+]）

對藥物抗性差異）

原生質(zhì)體的制備（高滲條件）

原生質(zhì)體再生（測定再生率）

融合（PEG、離心沉淀、電脈沖等）

融合子的檢出（直接檢出法和