艾拉莫德臨床前藥代動力學(xué)研究

艾拉莫德（T-614）的臨床前藥代動力學(xué)研高晶1*1，曾1，張2 藥物藥代動力學(xué)與藥效動力學(xué)國家， 沈陽藥學(xué)藥學(xué)院藥代，遼寧沈 摘要目的：研究T-614原料在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄、蛋白結(jié)合及口服原料和片劑的相對生物利用度；T-6145P450同工酶的體外抑制作用。方法：HPLCigT-6145、10LC/MS/MSigT-61450mg/kg后尿液中的主要代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了分析；采用高通量P450酶抑制劑篩選試劑盒測定了T-614原料對人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19CYP3A4的體外抑制活性。結(jié)果：igT-6145、1020mg/kg后主要藥動學(xué)參和（30.896.54）μg/mL，AUC0~t分別為（72.0811.05）（127.5317.68）和（296.2457.10）μg/mL·h；大鼠igT-614原料10mg/kg后在所有臟器組織中均能檢測到物質(zhì)，其中肝、腎、的量最高，腦的量最低；大鼠igT-614原料10mg/kg72h后，糞中的排泄率達(dá)到15.75%，而尿與膽汁的排泄率分別為0.836%和0.677%；當(dāng)質(zhì)量濃度為5、1020μg/mL時，T-614原料的蛋白結(jié)合率分別為（17.2±5.1）%（28.6±7.1）%和（28.910.2）%，平均蛋白結(jié)合率為（24.99.2）%。Beagle犬口服T-614原料和片劑5mg/kg，其主要藥動學(xué)參t1/2Ke分別為（11.101.50）和（9.303.29）h，t1/2Ka分別為（1.180.22）和（1.531.26）h，tmax分別為（4.240.48）和（4.231.75）h，Cmax分別為（0.770.13）和（1.010.27）μg/mL，AUC0~t分別為（12.69尿液中檢測到T-614的5種主要代謝物，包括T-614原結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體、苯環(huán)羥基化、脫醛基后再羥基化、脫醛料5、10和20mg/kg30%。糞、尿、膽汁中物質(zhì)的總排泄量低于20%。Beagle犬口服T-614片劑的相對生物利用度為132.5%。T-614對人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4無抑制作用。T-614在腎艾拉莫德（T-614）；藥代動力學(xué)；吸收；分布；排泄；代謝；蛋白結(jié)合；P450同工酶號 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 文章StudiesonpreclinicalpharmacokineticsofIguratimod（T-GAOJing1*,ZHIDe-guang1,ZENGYong1,ZHANGPeng2,LIUChang-CenterofNewEvaluationResearch,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,LaboratoryofPharmacokinetics, PharmaceuticalUniversity, ,110016, Objective:Tostudytheabsorption,distribution,excretion,metabolism,andproteinboundingofrawmaterialinvivoofanimalsandrelativebioavailabilityofT-614orallyrawmaterialsandtabletsandtheinhibitoryactivitiesofT-614to5kindsP450Isodynamicenzymes.Methods:UseHPLCmethodtocarryoutpharmacokineticsofT-614inratsatdosesof5,10and20mg/kg,andalsousethesamemethodtoobservetherelativebioavailabilityofT-614micro-powdertabletsbypoadministered5mg/kgtoBeagledog.UsingLC/MS/MSmethodtoyzethemetabolitesofT-61450mg/kginurineofrats.UsingP450HighthroughputInhibitorScreeningKittodeterminetheinhibitoryactivitiesofT-614toP450enzymes,CYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4.Results:Afterigadministrationof（127.53±17.68）,and（296.24±57.10）μg/mL·h,respectively.AfterigT-614（10mg/kg）torats,T-614inall tissueswasobserved,contentsinliverandkidneywerethe um,andtheminimuminbrain.During72hafteradministrationofT-614（10mg/kg）,excretionamountwas15.75%fromfaeces,butonly0.836%and0.677%fromurineandbile,respectively.At5,10,and20μg/mL,theproteinboundingrateofT-614was（17.2±5.1）%,（28.6±ofT-614andthetabletsinBeagledog,t1/2Kewas（11.10±1.50）and（9.30±3.29）h,t1/2Ka（1.18±0.22）and（1.53±1.26）h,tmax（4.24±0.48）and（4.23±1.75）h,Cmax（0.77±0.13）and（1.01±0.27）μg/mL,andAUC0~t（12.69±T-614intheurinewerefoundtohavefivekindsofmetabolicproducts,includingisomer,hydrogenation,dealdehydelation,andhydrogenationandamino-acetylationofdealdehydelationproductsofT-614.At20－0.0091μmol/LofT-614,theIC50wasover20μmol/LtoCYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4.Conclusion:AfterigadministrationofT-614（5,10,and20mg/kg）torats,theresultsindicatethatpharmacokineticstudyshowsorderkineticcharacteristics,distributionisbroaderineverytissueofrats,proteinboundingrateislower,andtotalexcretionamountsarelowerinurineandbile.OralrelativebioavailabilityoftheT-614tabletsinBeagledogis132.5%.T-614hasnoinhibitoryactiontoP450enzymes(CYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4).Themainmetabolismtransformationisisomer,hydrogenation,dealdehydelationandhydrogenationandamino-acetylationofdealdehydelationproductsofT-614.Key 自1992年學(xué)者Tanaka等[1]首次艾拉莫德（Iguratimod，T-614，圖1）的抗炎作用以直未停止[2]。1993年藥物與江蘇先聲藥物研究對T-614進(jìn)行了聯(lián)合開發(fā)，研究結(jié)果表明T-614是一種新型的具有多作用靶點的（DMARD，胞因子和B淋巴細(xì)胞，因此它是一種很有前途的新型DMARD[4]。在多中心劑量研究中，口服給藥劑量是50mg/d，75mg/d[5]。

圖1T-614化學(xué)結(jié)Fig.1StructureofT-T-614的臨床前藥代動力學(xué)系統(tǒng)研究和生物利用度試驗至今未見。根據(jù)我國新藥申請的技術(shù)指南，本課題組應(yīng)用大鼠和Beagle犬進(jìn)行了動物定性分析，對人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9CYP2C19和CYP3A442，由藥物化藥部提供；T-614片，規(guī)格：5號2001劑T-614藥北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心公司經(jīng)銷；乙于技磷量P450抑制劑篩選試劑盒（Hihhrouhputnhibitorgt、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19CYPA4，底物和陽性對照藥分別為：（1）AMMC和12.5μmol/L的喹尼?。╭uinidine2）CEC2.5（furafylline（3MFCμmol/L的磺胺苯吡唑（sulfaphenazole（4）CEC（tranylcypromine（5BFC125μmol/L的酮康唑（ketoconazole。Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量（200±20）g，藥物動物室提供。生產(chǎn)合格證：津管動001Beagle（101.0）kg，由新岡動物場提供，合格：滬動合格證字118SPD—10AUV檢測器，LabAllianceAS—3000自動進(jìn)樣器，ANASTAR色譜數(shù)據(jù)工作站；LC-MS分質(zhì)譜聯(lián)用儀，有電噴霧離子源（ESI）LCQ據(jù)處理系統(tǒng)，并配有直接進(jìn)樣用注射泵和250μL

96孔板（全黑）：Costar公司產(chǎn)品島津NL—200TPA分析天平，TGL—16C高速臺式離心機(jī)，安亭科學(xué)儀器廠。吸收183651020mg/kg，于給藥前0h和給藥后0.170.5、1、2、3、4、6、8、12、24h根據(jù)血藥濃度數(shù)據(jù)應(yīng)用3P97藥代計算程序進(jìn)行擬合計算藥動學(xué)參數(shù)，其中Cmax、tmax采用實測值，AUC采用統(tǒng)計矩法計算。 分別于給藥后1、4、12h處死一組動物，心、丸、等組織臟器，組織勻漿，測定相應(yīng)組排泄6，igT-6144～8、8～12、12～24、24～48、48～72h的糞樣膽管插管術(shù)，收集給藥前膽汁作為空白對照,mg/kg4～6、6～8、8～12、12～24h時間段的膽汁，測蛋白結(jié)合T-6143質(zhì)量濃度（5、10、20μgmL）448h，取大鼠血漿200μL，加入DMF200μL，振搖30s，15min，12000/mn10min，20μL色譜柱：C18柱（250mm4.6mm，10μm）；流動相：乙腈-0.1H3PO（40∶60柱溫：35HPLC法進(jìn)行Beagle靜脈取血2.1.2項下方法對血樣進(jìn)行處理后,以用3P97藥代計算程序進(jìn)行擬合計算藥動學(xué)參數(shù),LC/MSn給藥及樣品處理大鼠igT-614原料50m/kg后，收集24h尿液，用乙腈沉淀后以10000/min10min，取上清液進(jìn)樣分析色譜條件色譜柱為DiamonsilC18柱（200mm4.6mm，5μm，迪馬公司）；流動相為乙腈-水-甲酸（55∶450.5；體積流量為0.5mL/min；進(jìn)樣量20μL。質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀離子源為電噴霧離kV；毛細(xì)管溫度：200℃，毛細(xì)管電壓：13V；管透鏡補(bǔ)償電壓30V；碰撞氣為He；鞘氣和輔助氣（a.μ.；級質(zhì)譜（fullscanMS2）和全掃描三級質(zhì)譜（fullscanMS3）3種方式同時測定。對CYP采用高通量P450CYP450上讀出6（%近0%酶上下值（high%inhbiion%inhbition相

對應(yīng)的樣品濃度（highconcentrationlwconcentration，并按以下公式計算IC50。/inhibition-low%inhibition）+lowcon.結(jié)果不干擾樣品測定，內(nèi)標(biāo)和T-614的保留時間分別為6.5和10.2min。結(jié)果見圖2。血漿用終質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.5、2、5、10、25、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=20.764X+μg/mL的回收率分別為（101.4±7.2）%（99.4±1.8）%和（104.0±4.0）%；重現(xiàn)性、穩(wěn)定性的RSD10%以內(nèi)，均符合我國現(xiàn)行藥代動力學(xué)組織心標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=X－線方程：Y=23.006X－0.014（r0.9999）線性范圍0.1～5μg/mL；腎標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y22.736X+0.004（r0.9998）線性范圍0.2～5μg/mL；腦標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=23.917X－0.006（r0.9999）性范圍0.05～2μg/mL；肌肉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0（0.048（r0.9999），線性0.1～8μg/mL；糞標(biāo)準(zhǔn)大鼠血漿中T-614的濃度-時間曲線見圖力學(xué)參數(shù)見表1，3個劑量組Cmax、AUC0~t的相關(guān)0.9956），見表2。T-614在大鼠組織中的分igT-61410mg/kgT-614、脾、脂肪、肌肉、胃、腦，結(jié)果見圖4T-614在大鼠組織中的排

igT-61410mg/kg后，72h后累積排泄率達(dá)到總給藥量的0.8472h后累積排泄率達(dá)到總給藥量的15.75膽72h后累積排泄率達(dá)到總給藥量的0.68%，見表3。T-614的蛋白結(jié)率分別為（17.25.1）%（28.67.1）%（28.910.2）%，結(jié)果見表4。T-614在大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)21igT-61450mg/kgLC/MSn方法初步分離和分析，檢測到5種代謝物，結(jié)果如圖5所示，其中M1為T-614（S）的異構(gòu)體，其他代M2苯環(huán)羥基化、M3脫醛基后再羥基化、M4脫醛基后胺基乙?；521B51E2B51E2521FA-空白血漿；B-空白血漿+T-614+內(nèi)標(biāo)；C-igT-614血樣；D-igT-614糞樣；E-大鼠igT-614尿樣；F-igT-膽汁樣品;1-內(nèi)標(biāo)；2-T-A-blankplasma;B-blankplasma+T614+internalstandard;C-bloodsampleofratsigadministeredbyT-614;D-faecesofratsig圖2T-614血漿、糞、尿、膽汁樣Fig.2ChromatogramofT-614inplasma,faeces,urine,and表1大鼠igT-614后的主要藥代Table1MainpharmacokineticparametersofratsigadministeredbyT-參 單54.90±4.92±1.75±0.13±0.16±0.18±h0.16±0.30±0.58±h5.41±4.31±4.17±h0.81±1.16±1.78±7.83±15.46±30.89±μg·h·mL-mL·kg-1·h-0.08±0.09±0.08±m(xù)L·kg-0.61±0.55±0.51±表 Table2 ysisonTable2 ysisonCmaxandAUCatvariousCmax/（μgCmax/（μg·mL-57.83±15.46±30.89±0.9990.99550/ /圖3大鼠血漿T-614血藥濃度-時間曲Fig. Theserumconcentration-timecurveofT-614afterigadministrationto表3大鼠igT-61410mg/kg后的累計排Table3AccumulativeexcretionrateofT-614afterigadministration10mg/kgto累計排泄率時間糞尿2—46—8——藥物評價研究第32卷第1期2009年8 -25表4T-614血漿蛋白結(jié)合Table4ProteinboundingrateofT-蛋白結(jié)合率517.2±28.6±BeagleBeagleT-614原料5mg/kg和T-6145mg/kg后體內(nèi)的吸收符合一級動力學(xué)模型，血藥濃度-時間曲線見圖6，藥代動力學(xué)參數(shù)及相對生物利用度見表5。片劑的相對生物利用度為132.50，結(jié)果表明微粉化處理可以明顯提高生物對人P450同工酶CYP2D6CYP1A2CYP2C9CYP2C19和CYP3A4采用Gentest公司的高通量P450酶抑制劑篩選試劑盒（HighThroughputInhibitorScreening

Kit）T-614對CYP2D6、CYP1A2CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4共5種CYPs676結(jié)果顯示在本試驗條件下，5種已知的專一性抑制驗方法的可靠性。表7結(jié)果顯示T-614對CYP2D6CYP1A2CYP2C9、CYP2C19CYP3A4抑制的IC50均大于20μmol/L，μmol/L表 Beagle犬口服T-614原料與片劑后的主要藥動學(xué)參Table5PharmacokineticparametersofT-614afterporawmaterialsandtabletstobeagleT-614（5mg·kg-參 單

原 片 0.60± 0.71± 0.06± 0.08±h1.18±1.53±h11.10±9.30±h4.24±4.23±μg·mL-0.77±1.01±μg·h·mL-12.69±16.81±m(xù)L·kg-1·h-0.32±0.28±m(xù)L·kg-5.08±3.81±OSOCH

ONCHOSandM

SOCH

O OCH

SOCH

OOCHOCOM2 M

OSOCH

ONHO

OSOCH

ONHOM M 圖5T-614的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)Fig.5MetabolismtransformationofT-2.1.00

t/圖6Beagle犬口服T-614原料和片劑（5mg/kg）后血藥濃度-時間Fig. Theserumconcentration-timecurveofT-614afterporawmaterialsandtabletstobeagle 表6陽性對照藥物對CYPs酶活性Qui/（nmol?L-/酶活性Sul/（酶活性Qui/（nmol?L-/酶活性Sul/（nmol?L-Tra/（nmol?L-Ket/（nmol?L- /100/10100533/333111111331121117.202062

表7艾拉莫德對CYPs的抑制實驗結(jié)Table7InhibitoryactivitiesofT-614to酶活性 ig645100g/kg力學(xué)特點。在所有臟器組織中均能檢測到藥蛋01.50.84068。Beagle645g/kg135。在大鼠尿液中檢測到5種64以614的基乙酰化、脫醛基等為主要代謝轉(zhuǎn)化途徑。對C26、C12、CYP2C9、CYP2C19和

CYP3A4基本沒有抑制作用 614藥動學(xué)的系統(tǒng)研究的。614動物動學(xué)研究結(jié)果表明，14在動物體內(nèi)吸收迅速，消除較緩慢，為將來臨床用藥及劑型的確定提供了一些參考依據(jù)。6440酶無6145TanakaK,ShimotoriT,MakinoS,etal.Pharmacologicalstudiesofthenewanti-inflammatoryagent3-formy-lamino-7-methyl-sulfonylamino-6-phenoxy-4H-1-ben-zopyran-4-one.1stcommunication:anti-inflammatory,gesicandotherrelatedproperties[J].Arzneimit-Forschung,1992,42（7）:935-LiuCX.ReviewonthepharmacodynamicsandactionmechanismofIguratimod,anon-steroidalantiinflam-matorydrug[J].AsianJPharmacodynPharmaokinet,2007,7（1）:33-48.L