食品中乳酸菌的檢測(cè)

范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌 ( lacticacidbacteria )的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改單 )適用于本標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)語(yǔ)和定義3.1 乳酸菌 lacticacidbacteria一類(lèi)可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。 本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬 (Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium )和鏈球菌屬(Streptococcus)。設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1恒溫培養(yǎng)箱：36°C±1C。4.2冰箱：2C?5C。4.3均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。4.4天平：感量 0.1go4.5無(wú)菌試管：18mmK180mm、15mmK100mm。4.6無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。4.7無(wú)菌錐形瓶：500mL、250mL。培養(yǎng)基和試劑5.1 MRS(ManRogosaSharpe )培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽 (Li-Mupirocin )改良MRS培養(yǎng)基： 見(jiàn)附錄A中A.1。5.2 MC培養(yǎng)基(ModifiedChalmers 培養(yǎng)基)：見(jiàn)附錄 A中A.2。5.3 0.5%蔗糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。5.4 0.5%纖維二糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。5.5 0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。叮叮小文庫(kù)5.6 0.5%甘露醇發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。5.7 0.5%水楊苷發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。5.8 0.5%山梨醇發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。2叮叮小文庫(kù)5.9 0.5%乳糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.3。5.10七葉苷發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.45.11革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄 A中A.5。5.12 莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin ):化學(xué)純。5.13 半胱氨酸鹽酸鹽(CysteineHydrochloride ):純度〉99%檢驗(yàn)程序孚L酸菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。乳桿菌計(jì)數(shù)捉取艱岐稈菌或乳桿菌菌落接 種于MR5球脂平板I嗜熱璉球菌攝種于 MC瓊脂平■扳(可選做)菌種鑒定1圖1乳醋苗愴驗(yàn)程序圖操作步驟7.1樣品制備

S樣品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。冷凍樣品可先使其在 2C?5C條件下解凍，時(shí)間不超過(guò) 18h,也可在溫度不超過(guò) 45C的條件解凍，時(shí)間不超過(guò) 15min。3叮叮小文庫(kù)固體和半固體食品：以無(wú)菌操作稱取 25g樣品，置于裝有 225mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，于 8000r/min?10000r/min 均質(zhì)1min?2min，制成1:10樣品勻液；或置于 225mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中， 用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min?2min制成1:10的樣品勻液。液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品 25mL放入裝有225mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。7.2步驟用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有 9mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用 1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1:100的樣品勻液。另取1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做 10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用 1次1mL滅菌吸管或吸頭。孚L酸菌計(jì)數(shù)孚L酸菌總數(shù)根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)， 選擇2個(gè)?3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度， 每個(gè)稀釋度吸取 1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 50C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。 36C±1C厭氧培養(yǎng)48h翌h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在 15min內(nèi)完成。雙歧桿菌計(jì)數(shù)根據(jù)對(duì)待檢樣品雙歧桿菌含量的估計(jì)，選擇 2個(gè)?3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 50C的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的 MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均。36C±C厭氧培養(yǎng)48h±2h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾 注要求在15min內(nèi)完成。嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計(jì)，選擇 2個(gè)?3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻 至50C的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。 36C±1C需氧培養(yǎng)48h±4叮叮小文庫(kù)2h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。嗜熱鏈球菌在 MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑 2mr±1mm，菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。723.4乳桿菌計(jì)數(shù)723.1項(xiàng)乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去 項(xiàng)雙歧桿菌與 項(xiàng)嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計(jì)數(shù)。7.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器， 記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。 菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（ colony-formingunits , CFU）表示。選取菌落數(shù)在 30CFU?300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于 300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻， 即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以 2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。7.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。7.4結(jié)果的表述7.4.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。7.4.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：.............（式中:N――樣品中菌落數(shù)；H――平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和 ;n1――第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2――第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d――稀釋因子（第一稀釋度）。5叮叮小文庫(kù)743若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。744若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU?300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近 30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)小于 100CFU時(shí)，按 四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于 100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用 四舍五入”原則修約后，取前 2位數(shù)字，后面用 0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按 四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。稱重取樣以 CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以 CFU/mL為單位報(bào)告。結(jié)果與報(bào)告根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具報(bào)告，報(bào)告單位以 CFU/g（mL）表示。乳酸菌的鑒定（可選做）9.1純培養(yǎng)挑取3個(gè)或以上單個(gè)菌落，嗜熱鏈球菌接種于 MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于 MRS瓊脂平板，置 36C±C厭氧培養(yǎng)48h。9.2鑒定雙歧桿菌的鑒定按 GB4789.34的規(guī)定操作。涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長(zhǎng)桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為 0.5ym?2.0ym,成對(duì)或成鏈排列，無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。孚L酸菌菌種主要生化反應(yīng)見(jiàn)表 1和表2。6叮叮小文庫(kù)表1常見(jiàn)乳桿茵屈內(nèi)種的陽(yáng)水化合物反應(yīng)七纖菱甘水山M菌葉第芽題暢梨1芋昔二穩(wěn)醇昔陣權(quán)種擅■-3+■****■--_----++<--+d_■---+++444-444+-++<**++?述俸示時(shí)托M上苗株陽(yáng)性；-表牙死K以上菌株陰性：日表示"％~矽號(hào)菌株陽(yáng)性；HE）表示未測(cè)定一表2嗜熱惟球菌旳主娶土化反應(yīng)馬躍菌種乳穩(wěn)甘莊酶水楊肴山梨酶七葉昔嗜熱稱碌菌（必恥咖巧應(yīng)遊）-+-----WVVWWWWWVWV注-俵示兄X以上菌襪陽(yáng)性；-恚示兀昇以上茵柿陰性-附錄A培養(yǎng)基及試劑A.1MRS培養(yǎng)基成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐溫801.0mLK2HPO47H2O2.0g醋酸鈉3H2O5.0g檸檬酸二銨2.0gMgSO47H2O0.2gMnSO44H2O0.05g瓊脂粉15.0g7叮叮小文庫(kù)pH6.2制法將上述成分加入到 1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝后121C高壓滅菌15min?20min。莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良 MRS培養(yǎng)基莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液制備：稱取 50mg莫匹羅星鋰鹽加入到 50mL蒸餾水中，用 0.22m微孔濾膜過(guò)濾除菌。半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備：稱取 250mg莫匹羅星鋰鹽加入到 50mL蒸餾水中，用0.22m微孔濾膜過(guò)濾除菌。A.1.3.2制法將A.1.1成分加入到950mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121C高壓滅菌15min20min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48C,?用帶有0.22m微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50g/mL,半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500g/mL。A.2MC培養(yǎng)基A.2.1成分大豆蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g葡萄糖20.0g乳糖20.0g碳酸鈣10.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL5.0mL%中性紅溶液pH6.0制法將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，加入中性紅溶液。分裝后 121C8叮叮小文庫(kù)高壓滅菌15min?20min。9叮叮小文庫(kù)A.3乳酸桿菌糖發(fā)酵管A.3.1基礎(chǔ)成分牛肉膏5.0g蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g吐溫800.5mL瓊脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸餾水1000mLA.3.2制法,121C高壓滅菌15min按0.5%加入所需糖類(lèi)，并分裝小試管20min。A.4七葉苷培養(yǎng)基A.4.1成分蛋白胨5.0g磷酸氫二鉀1.0g七葉苷3.0g枸櫞酸鐵0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL蒸餾水100mLA.4.2制法將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121C高壓滅菌15minA.5革蘭氏染色液20min。A.5.1結(jié)晶紫染色液A.5.1.1成分結(jié)晶紫1.0g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mLA.5.1.2制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶