實時熒光定量PCR實驗中常見的幾個關(guān)鍵注意事項

本文格式為Word版，下載可任意編輯——實時熒光定量PCR實驗中常見的幾個關(guān)鍵注意事項周愛軍程澤影

近年，從科學(xué)研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟〞的檢測到“新冠病毒〞的檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學(xué)研究的常規(guī)設(shè)備。檢測方法的迅速發(fā)展，檢測任務(wù)的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練操作能力和分析判斷數(shù)據(jù)結(jié)果的能力。對于熒光定量PCR結(jié)果，最直觀的判斷就是看CT值和擴增曲線是否正常。好多人在平日試驗中會遇到異常擴增曲線的困擾，譬如，核酸污染風(fēng)險引起樣本陽性、打折的擴增曲線、復(fù)孔間重復(fù)性不好和陰性樣本擴增曲線抬升等。面對異常的擴增曲線，筆者將從以下幾個實例分析對比常見的異常擴增曲線產(chǎn)生的原因及其解決方法。

一、確定是否有核酸污染風(fēng)險的存在

由于在試驗過程中，簡單產(chǎn)生氣溶膠，造成樣本陽性，所以要做好設(shè)施和環(huán)境的消毒處理。

（一）有效消毒劑的選擇

消毒劑包括鄰苯基苯酚、次氯酸鹽、強堿類及戊二醛等。我們要根據(jù)不同的需要來選擇，如堿類（氫氧化鈉、氫氧化鉀等）、氯化物和酚化合物適用于建筑物、木質(zhì)結(jié)構(gòu)、水泥表面、設(shè)施設(shè)備的消毒，而酒精和碘化物適用于人員消毒。消毒劑必需有效，如“非洲豬瘟〞病毒，用0.8%氫氧化鈉、含2.3%有效氯的次氯酸鹽、0.3%福爾馬林溶液、3%鄰苯基苯酚和3%碘化合物，處理30min即可將其殺滅。

（二）儀器設(shè)備和環(huán)境的消毒

1.生物安全柜內(nèi)消毒。如進行“非洲豬瘟〞檢測活動時應(yīng)在生物安全柜中操作區(qū)鋪隔水墊，試驗后卷起隔水墊置于污物桶后消毒滅菌，采用有效消毒劑將生物安全柜內(nèi)操作區(qū)消毒處理1遍，再用清水浸泡紗布或吸水紙清洗1～2遍。

2.剪刀、鑷子等可重復(fù)使用物品消毒。剪刀、鑷子等可高壓滅菌的物品直接置于銳器盒高壓滅菌處理。不能高壓滅菌的物品考慮消毒劑浸泡，可用塑料盒盛裝有效消毒劑進行浸泡處理30min。不能用消毒劑浸泡但可高壓處理的，可放進生物安全滅菌袋后直接高壓蒸汽消毒（121℃，30min）。

3.儀器、工作臺面、地面、環(huán)境消毒。消毒的頻次可根據(jù)做試驗次數(shù)的多少來定，少時14d消毒1次，多時7d消毒1次?？捎米贤饩€燈消毒30～60min，但紫外線燈用久后不能起到殺滅微生物的效果，所以試驗終止后，儀器、工作臺面、地面、環(huán)境均應(yīng)用消毒液噴灑擦拭消毒。對金屬儀器等消毒時應(yīng)防止對儀器的腐蝕。試驗過程中若出現(xiàn)樣品溢灑或容器破碎等狀況，發(fā)生小量液體樣品溢灑時，應(yīng)用吸水紙吸干，然后在表面噴灑有效消毒劑進行處理。發(fā)生大量液體樣品溢灑時，應(yīng)當立刻用毛巾或紙巾覆蓋感染性物質(zhì)及相關(guān)破碎物品，然后在上面噴灑有效消毒劑，消毒30min。再對吸水毛巾或紙巾以及破碎物品進行清理（玻璃碎片應(yīng)用鑷子清理），然后再用有效消毒劑噴灑或擦拭污染區(qū)域。清理完畢后，應(yīng)對清潔用具及垃圾進行高壓滅菌。檢驗人員在整個操作過程中應(yīng)佩戴手套。清理操作區(qū)域及環(huán)境消毒完畢后，如水分蒸發(fā)導(dǎo)致臺面、內(nèi)壁等出現(xiàn)白色結(jié)晶現(xiàn)象，應(yīng)采用蒸餾水噴灑擦拭清理潔凈。另外，還要開負壓空氣過濾裝置，保持試驗室清白。

二、確定熒光定量PCR儀操作軟件設(shè)置的正確與否

試驗前檢驗員要對照試劑盒說明書，檢查熒光PCR儀設(shè)置的加熱時間、保持的溫度、循環(huán)的次數(shù)、熒光信號的采集和通道等是否與試劑盒說明書設(shè)置的要求一致。有一個對比簡單忽視的設(shè)置問題是需要看一下所選用的試劑中是否含有ROX來作為參比熒光染料。有的熒光定量PCR儀可以用ROX來作為參比熒光染料，用以校正儀器系統(tǒng)以外的物理誤差。例如，均一化的校正作用，由于移液誤差或者蒸發(fā)導(dǎo)致的一批熒光反應(yīng)管內(nèi)的體積誤差等。目前，市面上有的熒光定量PCR試劑盒預(yù)混液是不含有ROX參比熒光染料的，假如用此類試劑盒時，應(yīng)將ROX參比功能關(guān)閉，否則可能會出現(xiàn)圍繞基線上下波動的“鋸齒狀〞擴增曲線。遇到這種問題，可以在“菜單設(shè)置〞中找到“參比熒光染料〞功能，將ROX改為None，重新將樣本參與含熒光反應(yīng)液和聚合酶的反應(yīng)體系中重新進行擴增分析，結(jié)果就正常了。切記不要將原來的反應(yīng)管重新進行擴增1次，假如這樣，擴增曲線是一條直線，結(jié)果呈陰性，從而造成檢驗結(jié)果的錯誤。有的熒光定量PCR儀默認是對所有熒光通道及所有樣品孔進行熒光采集，用戶不用畏懼數(shù)據(jù)丟失，試驗終止后，可對儀器設(shè)置錯誤的反應(yīng)孔的熒光通道、樣品名稱等進行更改，結(jié)果就會顯示出正確的擴增曲線。

還有可能出現(xiàn)其他一些異常結(jié)果。如多組分圖擴增曲線沒有抬升，本應(yīng)是很明顯的陰性樣本，但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了，這樣抬升曲線就會與閾值線相交，反而出現(xiàn)了CT值。這主要是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現(xiàn)了錯誤，引起了擴增曲線的抬升。出現(xiàn)這種狀況首先可采取手動調(diào)整基線的方法，重新定義基線就可恢復(fù)正常。即將基線起點改為熒光信號穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)（一般是3）;基線終點則改成擴增曲線起峰的前一個循環(huán)數(shù)（譬如起峰是在第25個循環(huán)，那基線的終點就是24）。另外，引起這種現(xiàn)象發(fā)生的原因是所選耗材、試劑或者操作導(dǎo)致背景熒光信號有所波動，從而造成反應(yīng)孔的自動基線扣除錯誤，導(dǎo)致擴增曲線的抬升。

三、確定耗材和儀器配件是否使用正確

耗材對于熒光定量PCR來說十分重要，好多異常的擴增曲線是由于耗材使用不當引起的。

（一）錯誤使用普通PCR儀器所對應(yīng)的耗材

普通PCR耗材一般透光性不均勻，會造成熒光透過對比薄的地方，熒光信號強;透過對比厚的地

方，熒光信號弱。這樣會導(dǎo)致擴增熒光信號曲線時而上抬、時而下降的異常變動，從而出現(xiàn)擴增曲線打折的現(xiàn)象。

（二）未選擇跟儀器加熱模塊規(guī)格相匹配的耗材

有的熒光定量PCR儀加熱模塊分為兩種，試驗前一定要確定好自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來選擇相對應(yīng)的試驗耗材。假如小的加熱模塊使用較大的耗材，則會造成耗材壓扁，甚至造成機器出現(xiàn)故障并出現(xiàn)報警的現(xiàn)象;假如大的加熱模塊使用較小的耗材，則會造成反應(yīng)管的外壁和熒光定量PCR儀的溫控模塊沒有充分接觸，從而出現(xiàn)熱傳導(dǎo)不充分，進而影響聚合酶的活性，結(jié)果會引起同一個檢測樣本重復(fù)性不好，或者出現(xiàn)非特異擴增（溶解曲線多峰）現(xiàn)象，有的甚至出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

（三）使用了質(zhì)量對比差的耗材

大部分熒光定量PCR儀器是一個開放的平臺，客戶可以使用開放的試劑、開放的耗材。但是目前市面上熒光定量PCR耗材種類繁多，質(zhì)量也是千差萬別。在耗材選擇上，盡量選擇一些名牌企業(yè)的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，不要由于低廉選用質(zhì)量差或不符合要求的試驗耗材，帶來不必要的試驗錯誤。例如，使用質(zhì)量不好的耗材可能會引起熒光值不穩(wěn)定，從而造成反應(yīng)孔的自動基線扣除錯誤，得到不確切的CT值;使用質(zhì)量好的耗材，熒光信號正常，會出現(xiàn)明顯指數(shù)增長曲線和CT值。假如使用PCR封膜質(zhì)量不好的反應(yīng)管，在PCR擴增加熱過程中又受到蒸發(fā)的熱水蒸氣的影響，簡單產(chǎn)生變形，這樣會引起“熒光的折射〞，即“光學(xué)扭曲〞現(xiàn)象。該試驗假如使用了ROX作為參比熒光染料，ROX就會有效地校正這種熒光信號偏差，出現(xiàn)均勻的擴增曲線，其結(jié)果才是正常的。

四、確定所使用的試劑是否正常

假如無核酸污染風(fēng)險的存在、軟件設(shè)置都正確、試驗耗材及配件也沒有問題，但是擴增曲線還是異常，這個時候就要確定所用試劑是否正常。

（一）確定試劑是否有效

確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內(nèi)，是否反復(fù)凍融屢屢，運輸條件是否正常。可以通過對比試劑的批次號，結(jié)合試驗中的陽性、陰性對照結(jié)果，若陰性對照出現(xiàn)非特異性起跳，要先結(jié)合同一陰性對照的多組分圖，看看是否有擴增曲線;假如是由于背景熒光波動導(dǎo)致基線自動扣除錯誤導(dǎo)致的起跳，可通過手動調(diào)整基線的方式進行更改。假如是染料法實時熒光定量PCR試驗，可以通過溶解曲線來判斷是污染，還是引物二聚體;假如是探針法實時熒光定量PCR試驗，則可能是污染導(dǎo)致的起跳。只有陽性、陰性對照結(jié)果正確，才能確定試劑的有效性。

（二）觀測擴增后的試劑體積

假如在擴增過程中試劑中的水分蒸發(fā)，可能會引起擴增體系中擴增物質(zhì)濃度增高，在發(fā)射光源的照射下，熒光信號加強（熒光信號的強度與擴增物濃度呈正相關(guān)），出現(xiàn)熒光擴增曲線抬升的現(xiàn)象。假如試驗體系中參與了ROX作為參比熒光對照，ROX參比熒光染料可以區(qū)分擴增曲線抬升是真擴增，還是試劑蒸發(fā)引起的擴增。假如參比熒光物質(zhì)的反應(yīng)管沒蓋好或者使用了PCR封膜質(zhì)量不好的反應(yīng)管，就會造成ROX反應(yīng)體系有蒸發(fā)和水分丟失的現(xiàn)象，ROX參比熒光染料的濃度會漸漸地增加，結(jié)果就出現(xiàn)ROX參比熒光擴增曲線抬升現(xiàn)象，而正?？字蠷OX熒光會一直不變。所以在做PCR試驗加完試劑上機擴增時，一定要檢查PCR反應(yīng)管是否已經(jīng)蓋好并且密封嚴實。這樣既防止試劑蒸發(fā)影響檢測結(jié)果，又防止試劑蒸發(fā)形成氣溶膠。

五、確定試驗過程中的操作細節(jié)是否有誤

假如以上都正常，還要注意試驗過程中的操作細節(jié)。例如，在做標準曲線的時候，是不是梯度稀釋的標準品，假如不是梯度稀釋的標準品，可能會引起標準曲線擴增的效率或者R2值的異常。從冰箱冷凍室中取出的試劑是不均勻的，假如試劑溶化后沒有混勻，這時候取出的試劑是不均勻的，會影響后面的擴增。定量PCR預(yù)混液跟核酸模板加好