動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 思考題

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)思考題動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)思考題動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)思考題xxx公司動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)思考題文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》復(fù)習(xí)思考題動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)器皿清洗要求為何較高你認(rèn)為該如何保證器皿中無雜質(zhì)如果器皿中有雜質(zhì)，會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生什么樣的影響？

答：①離體細(xì)胞對(duì)各種毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未達(dá)到要求，各種毒物會(huì)損壞細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)。②器皿使用高壓滅菌鍋，℃，20~30分鐘，在取拿的時(shí)候用經(jīng)過高壓滅菌后的鑷子取拿，避免造成污染。③敘述超凈工作臺(tái)的工作原理答：超凈工作臺(tái)最主要的是空氣循環(huán)過濾的過程，在這個(gè)過程中風(fēng)機(jī)起到了心臟的作用。鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺(tái)面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。正壓過濾器為何會(huì)除菌答：正壓式過濾器沒有內(nèi)置滅菌燈，正壓式過濾器利用的是兩層孔的過濾膜，這層膜可以將細(xì)菌阻擋在膜上，過濾的液體流下去就基本上完成了滅菌過程各種細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制需要很精確嗎如果不精確，會(huì)導(dǎo)致什么后果請(qǐng)舉例說明。你認(rèn)為精確配制各種溶液答：配制后平衡鹽溶液呈黃色意味著液體的pH發(fā)生了什么變化？

答：配制后的液體應(yīng)呈桃紅色，PH值為左右。苯酚紅的變色域：（橙）~（黃），（棕色）~（紫色），若為黃色，則液體呈酸性，不利于細(xì)胞的生存。用于分離細(xì)胞的消化液為什么宜用無Ca、Mg離子的D-Hanks液或PBS液配制答：Ca＋2、Mg＋2是細(xì)胞膜的重要組分，具有使細(xì)胞凝聚的作用。因此，用于分離細(xì)胞的消化液宜用無Ca＋2、Mg＋2離子的D-Hanks液或PBS液。L-谷氨酰胺在營(yíng)養(yǎng)液中有何作用？答：L－谷氨酰胺是細(xì)胞的能量來源；是一種必須氨基酸，是使物體合成核酸、蛋白質(zhì)、嘌呤、嘧啶的重要前體，也是蛋白質(zhì)合成分解的調(diào)節(jié)物；是細(xì)胞內(nèi)氨的清除劑，氨對(duì)一些細(xì)胞有毒性。HEPES溶液的作用機(jī)理答：它是一種氫離子緩沖劑。主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)平衡鹽溶液的組成與基本作用小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中有哪些作用？

答：①平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成,它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡,保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng).主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。②作用：a提供能促使細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量微小的營(yíng)養(yǎng)物，以及某些低分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；

b提供結(jié)合蛋白，識(shí)別維生素、脂類、金屬離子，并與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用；c是細(xì)胞貼壁、鋪展生長(zhǎng)所需因子的來源；

d起酸堿度緩沖液作用；

e提供蛋白酶抑制劑，細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。營(yíng)養(yǎng)液制備后為什么要小劑量分裝？答：避免營(yíng)養(yǎng)液被污染后，全部的營(yíng)養(yǎng)液都被污染。營(yíng)養(yǎng)液一次用完過后，下一次的實(shí)驗(yàn)就不能用，會(huì)引起污染，影響實(shí)驗(yàn)，若冷凍營(yíng)養(yǎng)液，則營(yíng)養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)有所損失，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)10萬U/mL單位青霉素、鏈霉素的配制方法答：用注射器吸10毫升雙蒸水溶解100萬單位的鏈霉素，棄去2ml，用剩余的8ml鏈霉素溶解80萬單位的青霉素，配制成每毫升青霉素、鏈霉素各10萬單位的母液。細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)無菌的要求很高，你認(rèn)為該如何操作才能保證培養(yǎng)過程中無微生物污染？請(qǐng)?jiān)敿?xì)闡述。答：①實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)（laminarflow）以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作②無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)③進(jìn)無菌室前要徹底洗手④使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細(xì)菌的污染。⑤操作時(shí)盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。⑥）吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)專管專用⑦⑧你認(rèn)為組織塊培養(yǎng)成功需哪些條件？你們小組為了實(shí)驗(yàn)成功采取了哪些具體的措施你在本次實(shí)驗(yàn)中做了什么工作答：①實(shí)驗(yàn)所用的器材必須保證無菌無毒，用胰蛋白酶（濃度適中）消化的時(shí)間不宜過長(zhǎng)和過高、營(yíng)養(yǎng)、溫度組織塊培養(yǎng)的基本原理如何？答：細(xì)胞增殖何時(shí)須更換培養(yǎng)基進(jìn)行傳代？可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類來進(jìn)行后期的培養(yǎng)？答：①一般兩天換一次,如果細(xì)胞貼壁率變化不大,可以適當(dāng)延長(zhǎng),到細(xì)胞貼壁率達(dá)到85左右,可以傳代②不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)不用CO2或使用5%或10%CO2是否都可以說明原因答：不是。一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度.當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升g時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升時(shí),則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞.你認(rèn)為心肌細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作要點(diǎn)是什么？你在其中參與了什么操作有什么體會(huì)答：①要點(diǎn)：1）、首先用細(xì)胞分散法收獲細(xì)胞，隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察，并根據(jù)組織是否分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，采取終止消化措施。用篩網(wǎng)濾掉未消化的組織塊。2）、低速離心細(xì)胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。3）、用吸管吸取一定量的細(xì)胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。4）、將培養(yǎng)瓶放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。5）、每隔2到3天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時(shí)間。培養(yǎng)瓶移入CO2恒溫箱培養(yǎng)時(shí)，瓶蓋為何要稍松？又如何避免細(xì)胞污染如果細(xì)胞污染有何挽救措施答：①擰緊瓶蓋無法進(jìn)行氣體交換，瓶蓋稍松才能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的氧氣和二氧化碳，尤其是二氧化碳特別重要，細(xì)胞在酸性培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的更好②胰蛋白酶的消化原理如何？如何初步判斷胰蛋白酶的消化時(shí)間？答：①原理：細(xì)胞外含有多種胞外蛋白,如膠原蛋白；使細(xì)胞間或細(xì)胞與培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁粘連起來.用胰蛋白酶分解這些蛋白質(zhì)后就可以使它們分開了!②顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再鏈接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度