4789.2-2016菌落總數(shù)測(cè)定專題培訓(xùn)教材

4789.2－2016菌落總數(shù)測(cè)定專題培訓(xùn)教材應(yīng)用現(xiàn)狀1標(biāo)準(zhǔn)修訂標(biāo)準(zhǔn)詳解質(zhì)控要求234CONTENTS01

應(yīng)用現(xiàn)狀測(cè)定方法由來 目前面臨挑戰(zhàn)衛(wèi)生學(xué)的意義 檢驗(yàn)方法缺陷測(cè)定方法的由來培養(yǎng)方法4Koch面臨挑戰(zhàn)Peti1887年，Koch和Peti等用適當(dāng)?shù)幕|(zhì)、溫度、時(shí)間等條件，最終得到微生物可見菌落并進(jìn)行計(jì)數(shù)，這個(gè)方法一直沿用至今。不適合當(dāng)前生產(chǎn)活動(dòng)需要，在準(zhǔn)確度、適用性、成本等各方面被挑戰(zhàn)。但目前的所有官方標(biāo)準(zhǔn)都依然使用這個(gè)經(jīng)典的培養(yǎng)方法。衛(wèi)生學(xué)意義干擾因素較多容易受食品本底干擾。沒有實(shí)際意義結(jié)果可能沒有衛(wèi)生學(xué)意義。菌落總數(shù)主要用于判定樣品被污染程度。也可以用于監(jiān)測(cè)樣品中細(xì)菌的性質(zhì)和繁殖動(dòng)態(tài)，進(jìn)行樣品的衛(wèi)生學(xué)綜合評(píng)價(jià)。502

標(biāo)準(zhǔn)修訂方法標(biāo)準(zhǔn)演變 主要修訂內(nèi)容國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)背景 不同版本比較6菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的演變0102037GB/T

4789.2－84衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所歸口。南京市衛(wèi)生防疫站負(fù)責(zé)起草。主要起草人：吳光先培養(yǎng)方式為37

℃24

h培養(yǎng)方式改為36

℃48

hGB/T

4789.2－94衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)起草。主要起草人：劉宏道GB/T

4789.2－2003中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所負(fù)責(zé)起草。主要起草人：劉宏道、計(jì)融、付萍等僅僅修改標(biāo)準(zhǔn)文本格式標(biāo)準(zhǔn)修訂主要依據(jù)ISO

4833:2003Microbiology-Generalguidancefortheenumerationofmicro-organisms–Colonycounttechniqueat30

℃GB/T

4789.2－2008起草單位和起草人中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所負(fù)責(zé)起草。起草人：劉秀梅、盧行安、劉中學(xué)等標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施日期2008年11月21日發(fā)布，2009年3月1日正式實(shí)施8GB/T

4789.2－2008主要修訂內(nèi)容關(guān)鍵培養(yǎng)基計(jì)數(shù)瓊脂由營(yíng)養(yǎng)瓊脂改為平板計(jì)數(shù)瓊脂；兩個(gè)稀釋倍數(shù)增加了菌落總數(shù)計(jì)算公式；測(cè)試片方法增加了第二法 菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法；培養(yǎng)基和試劑增加了附錄A 培養(yǎng)基和試劑。Part

1Part

2Part

3Part

49菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的演變強(qiáng)制性食品安全標(biāo)準(zhǔn)10全國(guó)人民代表大會(huì)常務(wù)委員會(huì)于2009年2月28日發(fā)布的《中華人民共和國(guó)食品安全法》自2009年6月1日起施行。第十九條

食品安全標(biāo)準(zhǔn)是強(qiáng)制執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)。除食品安全標(biāo)準(zhǔn)外，不得制定其他的食品強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。按照《食品安全法》要求，2010年1月6日～8日在北京市召開了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂專家會(huì)。對(duì)涉及乳與乳制品的GB4789系列食品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行了修訂。專家在不同方面進(jìn)行了熱烈的討論，達(dá)成了共識(shí)。但是本次修訂時(shí)間匆促，又留下了一些紕漏。GB

4789.2－2010于2010年6月1日正式實(shí)施111菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的演變GB

4789.2－2010修訂內(nèi)容12中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所負(fù)責(zé)起草。主要起草人：劉秀梅、盧行安、袁寶君等與GB/T

4789.2-2008相比，主要修改如下：修改標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；修改菌落總數(shù)計(jì)算公式的解釋；修改培養(yǎng)基和試劑；刪除第二法PetrifilmTM測(cè)試片法。修改菌落總數(shù)的定義2.1 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需養(yǎng)性質(zhì)等），所得1

mL（或1

g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。GB/T

4789.2－2008GB4789.2－20102.1 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。菌落總數(shù)aerobicplatecount13修改菌落總數(shù)計(jì)算公式的解釋GB/T

4789.2－200814修改菌落總數(shù)計(jì)算公式的解釋GB

4789.2－2010151617標(biāo)準(zhǔn)修訂起草單位和主要起草人GB

4789.2－2016修訂主要起草單位中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院參加起草單位國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心福建出入境檢驗(yàn)檢疫局江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院南昌大學(xué)主要起草人袁

飛邵碧英祝長(zhǎng)青彭景賢徐劍宏吳麗萍劉秀梅18立項(xiàng)修訂國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)背景ISO

4833:2013AOACMFHPB-33-2001英國(guó)BS

EN分為傾注法和涂布法30℃培養(yǎng)加拿大食藥局是3M測(cè)試片法等同采用ISO483319采用了3M測(cè)試片法2008～2010版國(guó)標(biāo)參照ISO

4833:2003制定。2013年ISO

4833修訂為兩部分，分別采用傾注法和涂布法30

℃培養(yǎng)，與我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)差異較大。傾注法檢測(cè)限比涂布法低，靈敏度更高。因此，將涂布法加入標(biāo)準(zhǔn)的意義不大。以不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基檢測(cè)三類食品，以培養(yǎng)基的影響最顯著。20211984營(yíng)養(yǎng)瓊脂37

℃

24

h培養(yǎng)1994營(yíng)養(yǎng)瓊脂36

℃

48

h培養(yǎng)水產(chǎn)品30℃

72

h培養(yǎng)2003僅修改文本和格式2008計(jì)數(shù)培養(yǎng)基修改為平板計(jì)數(shù)瓊脂；增加PetrifilmTM測(cè)試片法2016整合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)演變過程2010將標(biāo)準(zhǔn)修改為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)；刪除PetrifilmTM測(cè)試片法22GB

4789.2不同版本比較23代號(hào)GB/T－84GB/T－94/－2003GB/T－2008GB－2010/－2016稀釋液生理鹽水/磷酸鹽緩沖液相同相同相同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)瓊脂相同培養(yǎng)溫度時(shí)間37℃24

h動(dòng)物性48

h36℃48

h水產(chǎn)品30℃相同相同兩個(gè)稀釋度計(jì)算比值計(jì)算比值計(jì)算公式計(jì)算公式單位個(gè)cfuCFU相同方法1種1種2種1種03

標(biāo)準(zhǔn)詳解術(shù)語和定義 設(shè)備和材料檢驗(yàn)的程序 結(jié)果和報(bào)告24010203040506檢驗(yàn)程序25操作步驟結(jié)果與報(bào)告術(shù)語和定義設(shè)備和材料培養(yǎng)基和試劑檢驗(yàn)方法步驟詳解3

設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)3.7

無菌吸管：1mL（具0.01mL刻設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：度）、10mL（具0.1mL

刻度）或微3.1

恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1

℃，30

℃量移液器及吸頭?！?

℃。3.8

無菌錐形瓶：容量250

mL、5003.2

冰箱：2℃～5℃。mL。3.3

恒溫水浴箱：46

℃±1℃。3.4

天平：感量為0.1

g。國(guó)外是2

kg±0.1

g無菌培養(yǎng)皿：直徑90

mm。pH計(jì)或pH比色管或精密pH試3.5

均質(zhì)器。紙。3.6

振蕩器。3.11

放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器。264 培養(yǎng)基和試劑4.14.24.3平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見A.1。27磷酸鹽緩沖液：見A.2。無菌生理鹽水：見A.3。5 檢驗(yàn)程序樣品前處理系列GB/T

4789.17肉與肉制品檢驗(yàn)GB

4789.18乳與乳制品檢驗(yàn)GB/T

4789.19蛋與蛋制品檢驗(yàn)GB/T

4789.20水產(chǎn)食品檢驗(yàn)GB/T

4789.21清涼飲料檢驗(yàn)GB/T

4789.22調(diào)味品檢驗(yàn)GB/T

4789.23冷食菜、豆制品檢驗(yàn)GB/T

4789.24糖果、糕點(diǎn)、果脯檢驗(yàn)GB/T

4789.25酒類檢驗(yàn)GB/T

4789.33糧谷、果蔬類食品檢驗(yàn)286.1.1

固體和半固體樣品：稱取25

g置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000

r/min～10000

r/min均質(zhì)1min～2 min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2

min，制成1:10的樣品勻液。6.1

樣品的稀釋常見問題使用剪刀加研缽方式均質(zhì)6

操作步驟29關(guān)注粘度FDA：7

s，30

cm，25次往返6.1.2

液體樣品：以無菌吸管吸取25

mL樣品置盛有225

mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。6.1

樣品的稀釋306.1.3

用1

mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1

mL，沿管壁緩慢注于盛有9

mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.1

樣品的稀釋31防止移液過程污染移液過程使用的器具，都應(yīng)避免微生物污染。使用耐高壓移液槍，核查洗耳球無菌程度，避免移液槍觸及均質(zhì)袋或試管內(nèi)壁……326.1

樣品的稀釋關(guān)注稀釋液滅菌后的體積6

操作步驟10

mL樣品勻液加入90

mL稀釋液的容器336.1.4 按6.1.3操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1

mL無菌吸管或吸頭。6.1

樣品的稀釋6.1.5

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1

mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1

mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。6

操作步驟346.1.6

及時(shí)將15

mL～20

mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46

℃±1

℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。6.1

樣品的稀釋操作細(xì)節(jié)瓊脂溫度控制瓊脂傾注數(shù)量瓊脂混勻程度水平放置凝固檢驗(yàn)過程時(shí)限35測(cè)試方法開啟平皿溫度適宜混勻方式加樣混勻方式重點(diǎn)關(guān)注平皿開啟、瓊脂恒溫、搖勻方式、培養(yǎng)基量、水平放置等是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。366.2

培養(yǎng)6.2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。水產(chǎn)品30 ℃±1 ℃培養(yǎng)72h±3

h。準(zhǔn)確判斷類別，避免法律糾紛376 操作步驟386.2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基

（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進(jìn)行培養(yǎng)。6

操作步驟菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming

units,

CFU）表示。39現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審不符合項(xiàng)不符合事實(shí)描述2016年CNAS現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審案例集實(shí)驗(yàn)室未配備滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的菌落計(jì)數(shù)器6 操作步驟6.3

菌落計(jì)數(shù)6.3.2 選取菌落數(shù)在30

CFU～300

CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30

CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300

CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３30 204 30 030×1030030 204 30 025×10250406 操作步驟6.3

菌落計(jì)數(shù)6.3.3 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。416 操作步驟6.3

菌落計(jì)數(shù)6.3.4 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。菌落間有明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)？若昆蟲侵入，在其爬行線路也會(huì)出現(xiàn)鏈狀菌落，是否將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)？427 結(jié)果與報(bào)告菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中的菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式（1）計(jì)算：N＝樣品中菌落數(shù)；∑C＝平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n１＝第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n２＝第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d

＝稀釋因子（第一稀釋度）（低）。舉例：1:100（第一稀釋度）

232，2441:1000（第二稀釋度）

33，

28這時(shí)，n１＝2，ｎ２＝1舉例：1:100（第一稀釋度）

332，2441:1000（第二稀釋度）

33，

28這時(shí)，n１＝1，ｎ２＝1437 結(jié)果與報(bào)告447.1

菌落總數(shù)的計(jì)算方法7.1.3

若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300

CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３多不可計(jì)多不可計(jì)460460×10３4.6×10５7 結(jié)果與報(bào)告菌落總數(shù)的計(jì)算方法若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30

CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３131013×10130各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３131013×10130000＜1×10＜10457 結(jié)果與報(bào)告7.1

菌落總數(shù)的計(jì)算方法7.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU～300 CFU之間，其中一部分小于30

CFU或大于300

CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300

CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３322.528228×10２2.8×10３各稀釋度菌落計(jì)數(shù)（CFU）計(jì)算值報(bào)告方式CFU/g10－１10－２10－３322.528228×10２2.8×10３312.528231×10２3.1×10３467

結(jié)果與報(bào)告平均值稀釋倍數(shù)報(bào)告結(jié)果78.510０7878.5798.510０88.592.510－１25300.510０0.5＜110.510－１5＜101047菌落總數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)小于100

CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。原則：衛(wèi)生狀況指示菌數(shù)量很少時(shí)（最低稀釋度少量菌落）具體是多少，實(shí)際意義不大。但從質(zhì)量管理考慮，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)明確規(guī)定結(jié)果報(bào)告方式。7.2 菌落總數(shù)的報(bào)告7.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。7

結(jié)果與報(bào)告平均值報(bào)告結(jié)果（CFU/mL）125125130100.5100101124.5120124130544.55405445503103103.1×10２487 結(jié)果與報(bào)告7.2

菌落總數(shù)的報(bào)告7.2.3

若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。爬行或菌落鏈瓊脂表面水膜皿底水膜49加樣后，盡快傾注瓊脂傾注后，不要急于封蓋凝固后，再次覆蓋瓊脂507

結(jié)果與報(bào)告7.2 菌落總數(shù)的報(bào)告7.2.4 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。計(jì)數(shù)空白平板上菌落數(shù)，在最終計(jì)算結(jié)果時(shí)予以扣除？空白有菌污染來源不明（培養(yǎng)基、稀釋液、均質(zhì)袋、培養(yǎng)皿、移液器、空氣、人工操作污染等）517 結(jié)果與報(bào)告527.2

菌落總數(shù)的報(bào)告7.2.5 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。檢驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果菌落總數(shù)，CFU/g＜10菌落總數(shù)，CFU/mL＜1附錄A培養(yǎng)基和試劑53平板計(jì)數(shù)瓊脂（platecount

agar，PCA）培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖液無菌生理鹽水A.1

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）胰蛋白胨 5.0

g酵母浸膏 2.5

g葡萄糖 1.0

g瓊 脂 15.0

g蒸餾水 1000

mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊

脂蒸餾水10.0

g3.0

g5.0

g15.0

g1000

mLA.1.2 制法 將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶，121

℃高壓滅菌15

min。5404

質(zhì)控要求遵循標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范 技術(shù)要求環(huán)節(jié)管理要求環(huán)節(jié) 結(jié)果報(bào)告部分55GB

4789.1－2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27405－2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范

食品微生物檢測(cè)國(guó)家食藥總局規(guī)定〔2016〕106號(hào)《食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定條件》和《食品檢驗(yàn)工作規(guī)范》自愿執(zhí)行的規(guī)范CNAS-CL01-A:2018檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說明YOURTITLE

HERE必須遵循的檢驗(yàn)規(guī)范56不確定度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用培養(yǎng)基的驗(yàn)收檢畢物品廢棄其他標(biāo)準(zhǔn)方法方法證實(shí)確認(rèn)質(zhì)量控制頻次報(bào)告方式執(zhí)行方法標(biāo)準(zhǔn)超出常規(guī)精度報(bào)告符合規(guī)定技術(shù)問題

管理要求環(huán)境條件要求解凍化凍方式樣品處理方式菌落數(shù)量異常菌落蔓延干擾顆粒干擾計(jì)數(shù)菌落總數(shù)測(cè)定屬于最基礎(chǔ)的食品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，但是很多實(shí)驗(yàn)室仍然沒有做到正確執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。其中，人員技術(shù)素質(zhì)是最重要的影響因素。菌落總數(shù)測(cè)定的不同環(huán)節(jié)57環(huán)境條件要求解凍化凍方式樣品處理方式菌落數(shù)量異常菌落蔓延干擾顆粒干擾計(jì)數(shù)技術(shù)問題58準(zhǔn)確標(biāo)示工作區(qū)域GB

4789.1－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》2.2.5 食品樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯標(biāo)示。59檢驗(yàn)環(huán)境條件的要求？FDA：工作臺(tái)面亮度足夠。操作時(shí)，同時(shí)測(cè)定工作區(qū)空氣沉降菌，15min暴露，菌落數(shù)≯15

CFU/皿。在工作臺(tái)面暴露平板，時(shí)間應(yīng)與從檢樣制備、稀釋到加入平皿時(shí)所暴露的最長(zhǎng)時(shí)間相當(dāng)。60設(shè)施和環(huán)境條件GB/T 27025

－

2008/ISO/IEC 17025

：2005檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求5.3.2

相關(guān)的規(guī)范、方法和程序有要求，或?qū)Y(jié)果的質(zhì)量有影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)監(jiān)測(cè)、控制和記錄環(huán)境條件。對(duì)諸如生物消毒、灰塵、電磁干擾、輻射、濕度、供電、溫度、聲級(jí)和振級(jí)等應(yīng)予以重視，使其適應(yīng)于相關(guān)的技術(shù)活動(dòng)。當(dāng)環(huán)境條件危及到檢測(cè)和（或）校準(zhǔn)的結(jié)果時(shí)，應(yīng)停止檢測(cè)和校準(zhǔn)。GB/T

27405－2008附錄B.2微生物無菌室的管理環(huán)境條件在使用前后應(yīng)進(jìn)行有效的消毒。無菌效果應(yīng)至少每?jī)芍茯?yàn)證一次。應(yīng)制定清潔、消毒、滅菌、使用和應(yīng)急處理程序。應(yīng)記錄環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果并歸檔保存。不符合規(guī)定時(shí)應(yīng)立即停止使用。6161常規(guī)微生物檢驗(yàn)分別戴帽、手套和口罩？根據(jù)檢測(cè)條件決定：檢驗(yàn)環(huán)境條件的要求有超凈工作臺(tái)、潔凈實(shí)驗(yàn)室的一般不需要。進(jìn)入生物安全實(shí)驗(yàn)室都需要。如果不確定防護(hù)效果，通過比對(duì)實(shí)驗(yàn)來確定。62培養(yǎng)箱環(huán)境條件要求培養(yǎng)箱空氣濕度48

h培養(yǎng)后，平板中瓊脂失重≯15％濕度過高－菌落蔓延濕度過低－培養(yǎng)基干燥注意利用并及時(shí)更新修正因子63樣品處理方式正確開啟樣品外包裝對(duì)于特殊樣品，如包裝飲用水、外包裝堅(jiān)硬的樣品，實(shí)驗(yàn)人員不能貪圖方便，而造成污染。64GB

4789.1－2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則解凍化凍方式5.1.3

冷凍食品應(yīng)在45

℃以下不超過15min，或2

℃～5

℃不超過18

h

解凍后進(jìn)行檢驗(yàn)。恒溫水浴放置位置65樣品處理方式樣品前處理原始記錄解凍化凍方式稱量原始記錄是否調(diào)節(jié)

pH特殊異常情況有生物安全風(fēng)險(xiǎn)或與檢驗(yàn)質(zhì)量沖突時(shí)，允許追記、補(bǔ)記！66特殊樣品稀釋倍數(shù)果膠等20倍或50倍稀釋算不算方法偏離？原則：僅改變了樣品的稀釋比例，沒有背離方法原理和操作路線。但從管理角度，特殊樣品的稀釋、報(bào)告方式應(yīng)明確為具體作業(yè)指導(dǎo)書。67時(shí)間限制范圍GB

4789.3－20167.1.5

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。 ……從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15

min。68菌落數(shù)量異常越稀釋，菌落數(shù)量越多如果高稀釋度的菌落數(shù)比低稀釋度的菌落數(shù)多，則說明檢驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)差錯(cuò)或樣品含抑菌物質(zhì)，檢驗(yàn)結(jié)果不可報(bào)告。三個(gè)連續(xù)稀釋度菌數(shù)都在范圍內(nèi)若有三個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，是否按公式計(jì)算？69所有平板上菌落數(shù)量均超過

300CFU，首選是重做實(shí)驗(yàn)。如果樣品無法重做，盡量計(jì)數(shù)，避免報(bào)告“多不可計(jì)”。平板上菌落過多70正確的做法添加0.05‰TTC的瓊脂顆粒干擾如（糕點(diǎn)、花生）檢樣稀釋液帶有顆粒嚴(yán)重影響判讀，通常建議使用添加TTC的平板計(jì)數(shù)瓊脂，利用細(xì)菌還原TTC顯色輔助觀察。使用帶有濾網(wǎng)的均質(zhì)袋。作一份平行檢樣對(duì)照，不經(jīng)培養(yǎng)，置2 ℃～5 ℃冰箱保存48 h。在平板計(jì)數(shù)時(shí)作為本底對(duì)照。71內(nèi)蒙古質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督2003年1期菌落總數(shù)檢測(cè)中的誤操作及避免方法72菌落總數(shù)測(cè)定常見的情況73不確定度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用培養(yǎng)基的驗(yàn)收檢畢物品廢棄其他標(biāo)準(zhǔn)方法方法證實(shí)確認(rèn)質(zhì)量控制頻次74管理要求測(cè)量不確定度的評(píng)定GB/T

27025-2008檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求5.4.6

測(cè)量不確定度的評(píng)定5.4.6.2

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有并應(yīng)用計(jì)測(cè)量不確定度的程序，

某些情況下檢測(cè)方法的性質(zhì)會(huì)妨礙對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行嚴(yán)密的計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的有效計(jì)算。這種情況下

，

實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)努力找出不確定度的所有分量且作出合理評(píng)定

，

并確保結(jié)果的報(bào)告方式不會(huì)對(duì)不確定度造成錯(cuò)覺。合理的評(píng)定應(yīng)依據(jù)對(duì)方法特性的理解和測(cè)量范圍

，

并利用諸如過去的經(jīng)驗(yàn)和確認(rèn)的數(shù)據(jù)。75測(cè)量不確定度的評(píng)定CNAS-CL01-A001:2018檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說明7.6

測(cè)量不確定度的評(píng)定7.6.3 在微生物檢測(cè)領(lǐng)域，某些情況下，一些檢測(cè)無法從計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行有效而嚴(yán)格的評(píng)估，這時(shí)至少應(yīng)通過分析方法，考慮它們對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的重要性，列出各主要的不確定度分量，并作出合理的評(píng)估。有時(shí)在重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)的基礎(chǔ)上估算不確定度也是合適的。76微生物測(cè)量不確定度評(píng)定SN/T

4091－2015食品微生物學(xué) 測(cè)量不確定度評(píng)估指南取10份雞肉樣品，由操作員A、B分別按照GB

4789.2進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，培養(yǎng)后得到計(jì)數(shù)結(jié)果并統(tǒng)計(jì)。77對(duì)同一樣品多次重復(fù)檢測(cè)以評(píng)定不確定度的做法是本末倒置的。因?yàn)闄z測(cè)樣品的某個(gè)項(xiàng)目（參數(shù)），是為了獲得該項(xiàng)目（參數(shù)）的具體量值而非不確定度。每個(gè)量值一旦檢測(cè)出來便具有其特定的不確定度，即當(dāng)某個(gè)項(xiàng)目（參數(shù)）的定量檢測(cè)完成后，就可以算出該項(xiàng)目（參數(shù)）結(jié)果的不確定度。目前，所有微生物檢驗(yàn)研究者都采用換算對(duì)數(shù)計(jì)算不確定度。但是數(shù)學(xué)的兩數(shù)和的對(duì)數(shù)不等于各數(shù)的對(duì)數(shù)之和。78微生物測(cè)量不確定度評(píng)定重要影響分量稱量精確度梯度稀釋比例／試管液體量稀釋液含有抑菌物質(zhì)吹吸的次數(shù)。葡萄球菌等樣品中微生物的吸附傾注培養(yǎng)基溫度培養(yǎng)時(shí)間／溫度培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量環(huán)境條件／光線／濁度等……79食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)30℃菌落計(jì)數(shù)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了30度需氧培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于人類食品和動(dòng)物飼料。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于檢測(cè)發(fā)酵的食品和動(dòng)物飼料。ISO

4833-1:2013食物鏈微生物學(xué)－微生物計(jì)數(shù)水平法－第1部分：30℃時(shí)菌落計(jì)數(shù)傾注平板技術(shù)SN/T

1800－2006菌落總數(shù)aerobicplatecount80重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性重復(fù)性（95％）SN/T1800－2006/ISO

4833-1:2013使用相同方法，在同一實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)同一種物質(zhì)，由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)的兩次獨(dú)立的單次試驗(yàn)結(jié)果的絕對(duì)差值，不應(yīng)大于重復(fù)性限（r＝0.25）。例：結(jié)果1.0×10５，另一結(jié)果范圍為：log104.75－log

105.25＝56000～17800081復(fù)現(xiàn)性（95％）SN/T1800－2006/ISO

4833-1:2013用同一方法檢測(cè)同一樣品、在不同實(shí)驗(yàn)室由不同操作者使用不同設(shè)備所得到的兩個(gè)單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的絕對(duì)差值，不大于復(fù)現(xiàn)性限（R＝0.45）。例：結(jié)果1.0×10５，另一結(jié)果范圍為：log104.55－log

105.45＝36000～28000082平皿菌落計(jì)數(shù)偏差常見不符合原因注意力不集中視力疲勞未充分辨認(rèn)菌落本人重復(fù)計(jì)數(shù)≤8％，他人計(jì)數(shù)≤10％83常見不符合原因84解決方案注意力不集中視力疲勞未充分辨認(rèn)菌落養(yǎng)成專心習(xí)慣不要長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)計(jì)數(shù)借助放大鏡／計(jì)數(shù)器平皿計(jì)數(shù)偏差控制菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)85標(biāo)準(zhǔn)菌株配置依據(jù)GB

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