骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件

骨髓檢查及細胞化學染色檢驗骨髓檢查及細胞化學染色檢驗1骨髓檢查及細胞化學染色檢驗掌握：常用細胞化學染色（過氧化物酶染色、過碘酸-雪夫染色、中性粒細胞堿性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特異性酯酶染色、堿性α-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶雙染色、骨髓鐵染色）的原理、方法、結果分析和臨床意義。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗掌握：2骨髓檢查及細胞化學染色檢驗熟悉：正常血細胞對化學染色的反應。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗熟悉：3骨髓檢查及細胞化學染色檢驗了解：流式細胞儀的構造、原理、主要技術指標和臨床應用。

染色體分析在臨床血液學中的應用。分子生物學檢查在血液學中的應用。常用FISH技術的種類、原理、方法和臨床應用。常用造血干/祖細胞培養(yǎng)的種類、原理和臨床應用。非顯帶染色體和顯帶染色體相關概念和技術。常見染色體數(shù)目和結構異常的有關概念和表示方法。核酸分子雜交技術原理和方法。聚合酶鏈反應原理和常用PCR產物檢查方法。以PCR為基礎的相關技術?；蛐酒夹g。細胞凋亡概念，細胞凋亡形態(tài)學的基本變化及主要生物化學特征。細胞凋亡的機制。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗了解：4細胞化學染色檢驗細胞化學染色，是一種以細胞形態(tài)學為基礎，結合運用化學反應的原理對血細胞內的各種化學物質作定位、定性及半定量分析的方法。細胞化學染色檢驗細胞化學染色，是一種以細胞形態(tài)學為基礎，結合5細胞化學染色檢驗血細胞化學染色的基本要求是在原位顯示細胞成分和結構，反應產物應是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細胞化學染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質等。細胞化學染色檢驗血細胞化學染色的基本要求是在原位顯示細胞成分6細胞化學染色檢驗基本步驟固定：蒸汽、液體固定有色沉淀反應：偶氮偶聯(lián)法、普魯士藍反應、雪夫反應、聯(lián)苯胺法復染細胞化學染色檢驗基本步驟7細胞化學染色檢驗臨床意義輔助判斷急性白血病的細胞類型輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷觀察疾病療效和判斷預后

探討某些疾病的發(fā)病機制

細胞化學染色檢驗臨床意義8一、過氧化物酶染色（POX）原理：粒細胞和單核細胞胞漿中含有的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能將底物過氧化氫分解，產生新生態(tài)氧，它將四甲基聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍自我脫氫氧化，顯棕色四甲基苯醌二胺，再加入亞硝基鐵氰化鈉與聯(lián)苯胺藍結合，可形成穩(wěn)定的藍色顆粒，定位于細胞漿內酶所在的部位。一、過氧化物酶染色（POX）原理：9POX結果判斷細胞質內有藍黑色顆粒者為陽性。（－）無顆粒沉著；（a）（±）顆粒細小，分布稀疏；（b）（+）顆粒較粗，局灶分布；（c）

（++）顆粒粗大，分布較密，占胞質1/2~2/3；（d）（+++）顆粒粗大，呈團塊分布；（e）（++++）全部胞質均部滿顆粒，可覆蓋胞核（f）。POX結果判斷細胞質內有藍黑色顆粒者為陽性。10各種細胞過氧化物酶染色

嗜堿粒細胞嗜酸性粒細胞原幼粒細胞各種細胞過氧化物酶染色嗜堿粒細胞嗜酸性粒細胞原幼粒細胞11骨髓片POX染色骨髓片POX染色12骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件13骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件14臨

床

意

義

POX染色是輔助診斷急性白血病細胞類型的首選、最重要的細胞化學染色。（1）粒系：POX主要分布在粒細胞和單核細胞內，隨著粒細胞成熟的程度而逐漸增強，中性分葉核粒細胞為強陽性。嗜酸性粒細胞陽性程度最強，其陽性顆粒比中性粒細胞粗大，有折光。嗜堿性粒細胞為陰性。臨

床

意

義POX染色是輔助診斷急性白血病細胞類型的15（2）單核細胞：原始單核細胞為陰性反應，幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應，顆粒細小，彌散分布。臨

床

意

義（2）單核細胞：臨

床

意

義16（3）其他細胞淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細胞、巨核細胞均呈陰性反應。（4）血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細胞的核膜上，可作為原巨核細胞的一種標志物，有助于FABM7的識別。臨

床

意

義（3）其他細胞淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細胞、巨17骨髓片POX染色APL：呈強陽性反應AML-M4：部分呈陽性反應，部分成弱陽性反應AML-M5：呈弱陽性ALL：呈陰性，<3%骨髓片POX染色APL：呈強陽性反應AML-M4：部分呈陽性18臨床意義（5）過氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型，急性髓細胞白血病多呈陽性反應，以M3和M2型反應最強，M1和M5型反應較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。急性淋巴細胞白血病呈POX陰性反應，故為急性髓細胞和淋巴細胞白血病鑒別的重要指標。臨床意義（5）過氧化物酶染色19二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕聯(lián)法，Kaplow）

中性粒細胞內堿性磷酸酶（neutrophilicalkalinephosphatase,NAP）在pH9.2~9.8時，能水解磷酸萘酚鈉，釋放出磷酸與萘酚，再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色沉淀于胞質內酶所存在的部位。二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕聯(lián)法20NAP結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)灰褐色至深黑色顆粒狀或片狀沉淀①（－）胞漿呈淡紅色，為0分。②（＋）胞質出現(xiàn)灰褐色沉淀，為1分。③（＋＋）胞質深褐色沉淀，為2分。④（＋＋＋）胞質中已基本充滿棕黑色顆粒狀沉淀，但密度較低，為3分。⑤（＋＋＋＋）胞質全被深黑色團塊沉淀所充滿，密度高，甚至遮蓋胞核，為4分。

NAP結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)灰褐21骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件22

NAP積分法

計數(shù)100個成熟中性粒細胞，按其反應強度分級，各級百分率與其級數(shù)乘積的總和，即為積分。例如：NAP反應結果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

積分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

參考值：正常人血細胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細胞（桿狀核及分葉核）可見陽性外，其他血細胞均為陰性。中性粒細胞NAP活性積分值一般為10～50分，但有時可高達162分。

NAP積分法23

臨床意義（1）生理變化：新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運動增高；月經期經前增高，行經后降低，經后期恢復正常；妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時達到高峰，產后恢復正常。臨床意義24（2）、病理變化

增高：嚴重化膿性感染、類白血病反應、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉移、MM、真紅、骨髓纖維化等。減低：PNH、CML、惡性組織細胞病、MDS。（2）、病理變化25骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件26骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件27三、蘇丹黑染色（SBB）原理：蘇丹黑B（sudanblackB,SB）是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細胞內的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使胞內微細結構的脂類物質也能顯示出來。結果：脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細胞漿中（+）顆粒很小，細小、稀疏，或胞質局部面積的1/4有致密的顆粒。（++）顆粒較少，或胞質面積的1/2出現(xiàn)黑色顆粒。（+++）顆粒較密，或胞質面積的3/4出現(xiàn)黑色顆粒。（++++）顆粒極密，顆粒間無間隙。三、蘇丹黑染色（SBB）原理：28各種細胞蘇丹黑B染色各種細胞蘇丹黑B染色29臨床意義蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似主要用于急性白血病類型的鑒別。蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細胞白血病可為陽性）。臨床意義30M1-SBB(+)M1-SBB(+)31M2-SBB(+)M2-SBB(+)32四、鐵染色原理：骨髓中的含鐵血黃素（細胞外鐵）和中、晚幼紅細胞胞漿中的鐵蛋白聚合物（細胞內鐵）經普魯士藍反應形成藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于細胞內外鐵存在的部位。正常人骨髓細胞外鐵為+~++。鐵粒幼細胞陽性率為12%~44%。鐵染色（ironstain；IS）中的細胞外鐵反映骨髓中鐵的儲存量，細胞內鐵反映骨髓中可利用鐵的量。四、鐵染色原理：33結果判斷（1）細胞外鐵的觀察：細胞外鐵呈藍色的顆粒狀、小株狀或團塊狀。以油鏡觀察定級標準（-）無鐵?？梢姟＃?）少數(shù)鐵?；蜩F小珠。（++）較多鐵粒和鐵小珠。（+++）很多鐵粒、鐵小珠和少數(shù)小塊。（++++）極多鐵粒、鐵小珠并有很多小塊，密集成堆。正常范圍：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3結果判斷（1）細胞外鐵的觀察：34細胞外鐵觀察陽性為藍綠色沉淀++++血色病+++AA、鐵粒幼貧血++感染+++AA、鐵粒幼貧血+NBM—IDA細胞外鐵觀察陽性為藍綠色沉淀+++++++++++++—35結果判斷（2）細胞內鐵觀察：

細胞內鐵指有核紅細胞胞質內出現(xiàn)藍色顆粒，以油鏡計100個中、晚幼紅細胞，記錄胞質中含有藍色小顆粒（即鐵粒紅細胞）的比值。并根據細胞鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布情況，將鐵粒幼紅細胞分為如下四型：Ⅰ型：僅含1-2個鐵顆粒。

Ⅱ型：含3-5個鐵顆粒。

Ⅲ型：含6-10個以上鐵顆粒。

Ⅳ型：>10個鐵顆粒。正常范圍：12%~44%，平均21.4%，多見Ⅰ型，少見Ⅱ型，無Ⅲ、Ⅳ型。結果判斷（2）細胞內鐵觀察：36細胞內鐵細胞內鐵37結果判斷（3）環(huán)形鐵粒幼紅細胞：指含鐵顆粒>6個，其中1/2以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。正常或非鐵粒幼細貧血無環(huán)形鐵粒幼細胞，鐵粒幼細貧血中環(huán)形鐵粒幼細胞>6%結果判斷（3）環(huán)形鐵粒幼紅細胞：38環(huán)形鐵粒幼細胞環(huán)形鐵粒幼細胞39

臨床意義1．缺鐵性貧血時，骨髓細胞外鐵明顯減少，為“一”~“士”，細胞內鐵平均5.9%，僅為I型。經有效鐵劑治療后，外鐵增多。因此骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導鐵劑治療的重要方法。2．鐵粒幼細胞性貧血時，外鐵“2＋”一“3＋”，內鐵平均70%，其鐵粒粗大，以Ⅱ～Ⅳ型為主，出現(xiàn)較多環(huán)形鐵粒幼細胞。因此，本實驗是診斷鐵粒幼細胞貧血的有效方法。MDS也可出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細胞。

3.非缺鐵性貧血如巨幼細胞貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等骨髓鐵正?；虿煌潭鹊脑黾印５偕系K性貧血不會出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細胞，可作為與MDS鑒別的參考。

4.繼發(fā)性貧血的部分患者細胞內鐵可減少，但細胞外鐵不減少。

臨床意義40五、過碘酸-雪夫染色（PAS）原理：過碘酸-雪夫（Periodicacid-schiff，PAS）染色又稱糖原染色。胞漿內存在的糖原或多糖類物質（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經過碘酸（Periodicacid）氧化，轉變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫（Schiff）試劑中的無色品紅結合，形成紫紅色化合物而沉積于胞漿中糖原類物質所存在的部位。該反應稱為過碘酸-雪夫（PAS）陽性反應。

五、過碘酸-雪夫染色（PAS）原理：41PAS結果判斷細胞質內有出現(xiàn)紅色顆粒、塊狀或呈彌漫狀紅色者為陽性。①（－）胞質無色，無顆粒。②（+）胞質淡紅色或有少量紅色顆粒，通常＜10個顆粒。③（++）胞質紅色或有10個以上紅色顆粒。④（+++）胞質呈暗紅色或有粗大紅色顆粒，可出現(xiàn)紅色塊狀。⑤（++++）胞質呈紫紅色或有粗大紅色塊狀。

PAS結果判斷細胞質內有出現(xiàn)紅色顆粒、塊狀42

臨床意義（1）M6與巨幼貧的鑒別

M6的幼紅細胞PAS可呈強陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時PAS反應為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細胞白血病時原單核細胞及幼單核細胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。臨床意義43PAS染色AML-M6幼紅細胞呈陽性反應MA幼紅細胞呈陰性反應PAS染色AML-M6MA44ALL-L1ALL-L145L1PAS(+)L1PAS(+)46AML-M5AML-M547M5PAS(+)M5PAS(+)48AML-M6AML-M649AML-M6PAS(+)AML-M6PAS(+)50AML-M7AML-M751M7PAS(+)M7PAS(+)52（3）巨核細胞和Sternberg細胞鑒別巨核細胞PAS強陽性，Sternberg細胞為陰性或弱陽性。（4）戈謝氏細胞強陽性，尼曼-皮克細胞陰性或弱陽性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細胞的糖原積分增高；一般的病毒感染，糖原積分在正常范圍內。（3）巨核細胞和Sternberg細胞鑒別53六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：細胞內的氯乙酸AS－D萘酚酯酶（naphytholAS-Dchloroacetateesterase,NAS-DCE）水解基質液中的氯乙酸AS－D萘酚，產生AS－D萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所存在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢紫醬GBC，形成的有色沉淀為紅色。NAS－DCE幾乎僅出現(xiàn)在粒細胞，其特異性高，因此又稱為“粒細胞酯酶”、“特異性酯酶”。六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：54結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)紅色沉淀①（－）胞質無色。②（＋）胞質呈淡紅色。③（＋＋）鮮紅色沉淀布滿胞質。④（＋＋＋）深紅色沉淀充滿胞質。結果判斷陽性結果為胞質內出55

臨床意義1．急性粒細胞白血病和急性早幼粒細胞白血病原粒細胞NAS－DCE染色多呈（＋）~（＋＋）。白血病性早幼粒細胞呈（＋＋）~（＋＋＋）。2．急性單核細胞白血病原、幼單核細胞多呈陰性反應。3．急性淋巴細胞白血病原、幼淋巴細胞呈陰性反應。。臨床意義56七、中性非特異性酯酶染色

原理：中性非特異性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-Dacetateesterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）染色。細胞內的α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）在pH中性的條件下水解基質液中的α-醋酸萘酚，釋放出α-萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色，α-NAE存在于單核細胞、粒細胞和淋巴細胞中，故它是一種中性非特異性酯酶。七、中性非特異性酯酶染色原理：57結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)藍色或棕黑色顆粒沉淀

①（－）無顆粒沉淀，為0分。②（±）顆粒少量、稀疏，為0.5分。③（＋）胞質內1/2區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為1分。④（＋＋）胞質內3/4區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為2分。⑤（＋＋＋）胞質內布滿顆粒沉淀，為3分。⑥（＋＋＋＋）胞質內充滿濃密的顆粒沉淀，為4分。結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)58

臨床意義NAS－DAE染色屬于中性非特異性酯酶染色，在鑒別白血病類型時需同時做NaF抑制試驗。

1．急性粒細胞白血病原粒細胞NAS－DAE染色可呈陽性反應，且不被氟化鈉抑制。2．急性早幼粒細胞白血病白血病性早幼粒細胞NAS－DAE染色為陽性或強陽性反應，亦不被氟化鈉所抑制。3．急性單核細胞白血病原、幼單核細胞NAS－DAE染色多呈陽性或強陽性反應，但能被氟化鈉抑制

臨床意義59骨髓NAS-DAE染色及氟化鈉抑制反應

骨髓NAS-DAE染色及氟化鈉抑制反應60骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件61骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件62細胞化學染色檢驗小結細胞化學染色檢驗小結63幾種常見急性白血病的細胞化學染色結果急淋急粒急單紅白血病POX藍黑色－+~+++－~+視合并的白細胞類型而定SB黑棕黑色－++~+++－~+同上AS-DNCE紅－－~+++－~+同上α-NAE棕黑－~++－~+++同上α-NAE-NaF不被NaF抑制被NaF抑制同上NAP褐-深黑增加減少正?；蛟黾油螾AS紅+，粗顆粒狀或塊狀－或+，彌漫性淡紅色－或+，彌漫性淡紅色+++幾種常見急性白血病的細胞化學染色結果急淋急粒急單紅白血病PO64各型急性白血病細胞的化學染色特征

POXPASNAS－DCENAS－DAE（＋NaF） NAP

急淋（L1-L3

）(-)(+)～(+++)(-)(-)～(+)不抑制 ↑

急粒（M1M2）(-)～(++)(-)～(+) (+)～(++)(-)～(+)不抑制 ↓

急早幼粒（M3）(+++)～(++++)(+)～(+++)(++)～(+++)(+)～(+++)不抑制 ↓

急粒單（M4）(-)～(++) (-)～(++)(-)～(++)(+)～(+++)部分抑制↑或↓

急單（M5）(-)～(+)(-)～(++)(-)(++)～(+++)抑制 ↑或↓

紅白血?。∕6）

(-)(+)～(+++)(-) (-) ↓幼紅細胞

急巨（M7）(-)(+)～(+++)(-) (-）↓

各型急性白血病細胞的化學染色特征

POX65自學內容骨髓活檢細胞因子的檢驗造血細胞培養(yǎng)檢驗血細胞染色體檢驗和分子生物學檢查細胞調亡自學內容骨髓活檢661.常用的化學反應種類不包括下列哪種A.偶氮偶聯(lián)法B.聯(lián)苯胺法C.普魯士藍反應D.中和反應E.雪夫反應2.臨床上輔助判斷急性白血病類型首選最重要的細胞化學染色是A.特異性脂酶B.非特異性脂酶C.過氧化物酶D.中性粒細胞堿性磷酸酶E.酸性磷酸酶3.特異性及非特異性脂酶的染色方法是A.偶氮偶聯(lián)法B.聯(lián)苯胺法C.普魯士藍反應D.中和反應E.雪夫反應1.常用的化學反應種類不包括下列哪種674.鑒別小原粒白血病與急淋，下列首選試驗是A.脂酶染色B.糖原染色C.過氧化物酶染色D.堿性磷酸酶染色E.酸性磷酸酶染色5.非特異性脂酶染色陽性，且陽性反應能被氟化鈉抑制見于A.急性粒細胞白血病B.急性淋巴細胞白血病C.急性單核細胞白血病D.急性早幼粒細胞白血病E.慢性粒細胞白血病6.輔助判斷急性白血病類型的細胞化學染色不包括A.過氧化物酶染色脂酶染色B.中性粒細胞堿性磷酸酶染色

C.鐵染色D.糖原染色E.非特異性酯酶染色4.鑒別小原粒白血病與急淋，下列首選試驗68懶人無法享受休息之樂。——拉布克努力耕耘，少問收獲。共同的事業(yè)，共同的斗爭，可以使人們產生忍受一切的力量?！獖W斯特洛夫斯基你熱愛生命嗎？那么別浪費時間，因為時間是組成生命的材料。——富蘭克林人生，就要活得漂亮，走得鏗鏘。自己不奮斗，終歸是擺設。無論你是誰，寧可做拼搏的失敗者，也不要做安于現(xiàn)狀的平凡人。你要結交敢于指責你缺點，當面批評你的人，遠離恭維你缺點，一直對你嘻嘻哈哈的人！雄心壯志是茫茫黑夜中的北斗星。小時候我以為自己長大后可以拯救整個世界，長大后才發(fā)現(xiàn)整個世界都拯救不了我。崇高的理想就象生長在高山上的鮮花。如果要搞下它，勤奮才能是攀登的繩索。不要過分倉促地相信和欽佩德育教員：他們說話像天使，生活卻像凡人?！s翰遜身體健康，學習進步！懶人無法享受休息之樂。——拉布克身體健康，學習進步！骨髓檢查及細胞化學染色檢驗骨髓檢查及細胞化學染色檢驗70骨髓檢查及細胞化學染色檢驗掌握：常用細胞化學染色（過氧化物酶染色、過碘酸-雪夫染色、中性粒細胞堿性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特異性酯酶染色、堿性α-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶雙染色、骨髓鐵染色）的原理、方法、結果分析和臨床意義。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗掌握：71骨髓檢查及細胞化學染色檢驗熟悉：正常血細胞對化學染色的反應。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗熟悉：72骨髓檢查及細胞化學染色檢驗了解：流式細胞儀的構造、原理、主要技術指標和臨床應用。

染色體分析在臨床血液學中的應用。分子生物學檢查在血液學中的應用。常用FISH技術的種類、原理、方法和臨床應用。常用造血干/祖細胞培養(yǎng)的種類、原理和臨床應用。非顯帶染色體和顯帶染色體相關概念和技術。常見染色體數(shù)目和結構異常的有關概念和表示方法。核酸分子雜交技術原理和方法。聚合酶鏈反應原理和常用PCR產物檢查方法。以PCR為基礎的相關技術。基因芯片技術。細胞凋亡概念，細胞凋亡形態(tài)學的基本變化及主要生物化學特征。細胞凋亡的機制。骨髓檢查及細胞化學染色檢驗了解：73細胞化學染色檢驗細胞化學染色，是一種以細胞形態(tài)學為基礎，結合運用化學反應的原理對血細胞內的各種化學物質作定位、定性及半定量分析的方法。細胞化學染色檢驗細胞化學染色，是一種以細胞形態(tài)學為基礎，結合74細胞化學染色檢驗血細胞化學染色的基本要求是在原位顯示細胞成分和結構，反應產物應是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細胞化學染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質等。細胞化學染色檢驗血細胞化學染色的基本要求是在原位顯示細胞成分75細胞化學染色檢驗基本步驟固定：蒸汽、液體固定有色沉淀反應：偶氮偶聯(lián)法、普魯士藍反應、雪夫反應、聯(lián)苯胺法復染細胞化學染色檢驗基本步驟76細胞化學染色檢驗臨床意義輔助判斷急性白血病的細胞類型輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷觀察疾病療效和判斷預后

探討某些疾病的發(fā)病機制

細胞化學染色檢驗臨床意義77一、過氧化物酶染色（POX）原理：粒細胞和單核細胞胞漿中含有的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能將底物過氧化氫分解，產生新生態(tài)氧，它將四甲基聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍自我脫氫氧化，顯棕色四甲基苯醌二胺，再加入亞硝基鐵氰化鈉與聯(lián)苯胺藍結合，可形成穩(wěn)定的藍色顆粒，定位于細胞漿內酶所在的部位。一、過氧化物酶染色（POX）原理：78POX結果判斷細胞質內有藍黑色顆粒者為陽性。（－）無顆粒沉著；（a）（±）顆粒細小，分布稀疏；（b）（+）顆粒較粗，局灶分布；（c）

（++）顆粒粗大，分布較密，占胞質1/2~2/3；（d）（+++）顆粒粗大，呈團塊分布；（e）（++++）全部胞質均部滿顆粒，可覆蓋胞核（f）。POX結果判斷細胞質內有藍黑色顆粒者為陽性。79各種細胞過氧化物酶染色

嗜堿粒細胞嗜酸性粒細胞原幼粒細胞各種細胞過氧化物酶染色嗜堿粒細胞嗜酸性粒細胞原幼粒細胞80骨髓片POX染色骨髓片POX染色81骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件82骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件83臨

床

意

義

POX染色是輔助診斷急性白血病細胞類型的首選、最重要的細胞化學染色。（1）粒系：POX主要分布在粒細胞和單核細胞內，隨著粒細胞成熟的程度而逐漸增強，中性分葉核粒細胞為強陽性。嗜酸性粒細胞陽性程度最強，其陽性顆粒比中性粒細胞粗大，有折光。嗜堿性粒細胞為陰性。臨

床

意

義POX染色是輔助診斷急性白血病細胞類型的84（2）單核細胞：原始單核細胞為陰性反應，幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應，顆粒細小，彌散分布。臨

床

意

義（2）單核細胞：臨

床

意

義85（3）其他細胞淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細胞、巨核細胞均呈陰性反應。（4）血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細胞的核膜上，可作為原巨核細胞的一種標志物，有助于FABM7的識別。臨

床

意

義（3）其他細胞淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細胞、巨86骨髓片POX染色APL：呈強陽性反應AML-M4：部分呈陽性反應，部分成弱陽性反應AML-M5：呈弱陽性ALL：呈陰性，<3%骨髓片POX染色APL：呈強陽性反應AML-M4：部分呈陽性87臨床意義（5）過氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型，急性髓細胞白血病多呈陽性反應，以M3和M2型反應最強，M1和M5型反應較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。急性淋巴細胞白血病呈POX陰性反應，故為急性髓細胞和淋巴細胞白血病鑒別的重要指標。臨床意義（5）過氧化物酶染色88二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕聯(lián)法，Kaplow）

中性粒細胞內堿性磷酸酶（neutrophilicalkalinephosphatase,NAP）在pH9.2~9.8時，能水解磷酸萘酚鈉，釋放出磷酸與萘酚，再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色沉淀于胞質內酶所存在的部位。二、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕聯(lián)法89NAP結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)灰褐色至深黑色顆粒狀或片狀沉淀①（－）胞漿呈淡紅色，為0分。②（＋）胞質出現(xiàn)灰褐色沉淀，為1分。③（＋＋）胞質深褐色沉淀，為2分。④（＋＋＋）胞質中已基本充滿棕黑色顆粒狀沉淀，但密度較低，為3分。⑤（＋＋＋＋）胞質全被深黑色團塊沉淀所充滿，密度高，甚至遮蓋胞核，為4分。

NAP結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)灰褐90骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件91

NAP積分法

計數(shù)100個成熟中性粒細胞，按其反應強度分級，各級百分率與其級數(shù)乘積的總和，即為積分。例如：NAP反應結果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

積分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

參考值：正常人血細胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細胞（桿狀核及分葉核）可見陽性外，其他血細胞均為陰性。中性粒細胞NAP活性積分值一般為10～50分，但有時可高達162分。

NAP積分法92

臨床意義（1）生理變化：新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運動增高；月經期經前增高，行經后降低，經后期恢復正常；妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時達到高峰，產后恢復正常。臨床意義93（2）、病理變化

增高：嚴重化膿性感染、類白血病反應、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉移、MM、真紅、骨髓纖維化等。減低：PNH、CML、惡性組織細胞病、MDS。（2）、病理變化94骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件95骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件96三、蘇丹黑染色（SBB）原理：蘇丹黑B（sudanblackB,SB）是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細胞內的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使胞內微細結構的脂類物質也能顯示出來。結果：脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細胞漿中（+）顆粒很小，細小、稀疏，或胞質局部面積的1/4有致密的顆粒。（++）顆粒較少，或胞質面積的1/2出現(xiàn)黑色顆粒。（+++）顆粒較密，或胞質面積的3/4出現(xiàn)黑色顆粒。（++++）顆粒極密，顆粒間無間隙。三、蘇丹黑染色（SBB）原理：97各種細胞蘇丹黑B染色各種細胞蘇丹黑B染色98臨床意義蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似主要用于急性白血病類型的鑒別。蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細胞白血病可為陽性）。臨床意義99M1-SBB(+)M1-SBB(+)100M2-SBB(+)M2-SBB(+)101四、鐵染色原理：骨髓中的含鐵血黃素（細胞外鐵）和中、晚幼紅細胞胞漿中的鐵蛋白聚合物（細胞內鐵）經普魯士藍反應形成藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于細胞內外鐵存在的部位。正常人骨髓細胞外鐵為+~++。鐵粒幼細胞陽性率為12%~44%。鐵染色（ironstain；IS）中的細胞外鐵反映骨髓中鐵的儲存量，細胞內鐵反映骨髓中可利用鐵的量。四、鐵染色原理：102結果判斷（1）細胞外鐵的觀察：細胞外鐵呈藍色的顆粒狀、小株狀或團塊狀。以油鏡觀察定級標準（-）無鐵粒可見。（+）少數(shù)鐵?；蜩F小珠。（++）較多鐵粒和鐵小珠。（+++）很多鐵粒、鐵小珠和少數(shù)小塊。（++++）極多鐵粒、鐵小珠并有很多小塊，密集成堆。正常范圍：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3結果判斷（1）細胞外鐵的觀察：103細胞外鐵觀察陽性為藍綠色沉淀++++血色病+++AA、鐵粒幼貧血++感染+++AA、鐵粒幼貧血+NBM—IDA細胞外鐵觀察陽性為藍綠色沉淀+++++++++++++—104結果判斷（2）細胞內鐵觀察：

細胞內鐵指有核紅細胞胞質內出現(xiàn)藍色顆粒，以油鏡計100個中、晚幼紅細胞，記錄胞質中含有藍色小顆粒（即鐵粒紅細胞）的比值。并根據細胞鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布情況，將鐵粒幼紅細胞分為如下四型：Ⅰ型：僅含1-2個鐵顆粒。

Ⅱ型：含3-5個鐵顆粒。

Ⅲ型：含6-10個以上鐵顆粒。

Ⅳ型：>10個鐵顆粒。正常范圍：12%~44%，平均21.4%，多見Ⅰ型，少見Ⅱ型，無Ⅲ、Ⅳ型。結果判斷（2）細胞內鐵觀察：105細胞內鐵細胞內鐵106結果判斷（3）環(huán)形鐵粒幼紅細胞：指含鐵顆粒>6個，其中1/2以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。正?；蚍氰F粒幼細貧血無環(huán)形鐵粒幼細胞，鐵粒幼細貧血中環(huán)形鐵粒幼細胞>6%結果判斷（3）環(huán)形鐵粒幼紅細胞：107環(huán)形鐵粒幼細胞環(huán)形鐵粒幼細胞108

臨床意義1．缺鐵性貧血時，骨髓細胞外鐵明顯減少，為“一”~“士”，細胞內鐵平均5.9%，僅為I型。經有效鐵劑治療后，外鐵增多。因此骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導鐵劑治療的重要方法。2．鐵粒幼細胞性貧血時，外鐵“2＋”一“3＋”，內鐵平均70%，其鐵粒粗大，以Ⅱ～Ⅳ型為主，出現(xiàn)較多環(huán)形鐵粒幼細胞。因此，本實驗是診斷鐵粒幼細胞貧血的有效方法。MDS也可出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細胞。

3.非缺鐵性貧血如巨幼細胞貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等骨髓鐵正常或不同程度的增加。但再生障礙性貧血不會出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細胞，可作為與MDS鑒別的參考。

4.繼發(fā)性貧血的部分患者細胞內鐵可減少，但細胞外鐵不減少。

臨床意義109五、過碘酸-雪夫染色（PAS）原理：過碘酸-雪夫（Periodicacid-schiff，PAS）染色又稱糖原染色。胞漿內存在的糖原或多糖類物質（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經過碘酸（Periodicacid）氧化，轉變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫（Schiff）試劑中的無色品紅結合，形成紫紅色化合物而沉積于胞漿中糖原類物質所存在的部位。該反應稱為過碘酸-雪夫（PAS）陽性反應。

五、過碘酸-雪夫染色（PAS）原理：110PAS結果判斷細胞質內有出現(xiàn)紅色顆粒、塊狀或呈彌漫狀紅色者為陽性。①（－）胞質無色，無顆粒。②（+）胞質淡紅色或有少量紅色顆粒，通常＜10個顆粒。③（++）胞質紅色或有10個以上紅色顆粒。④（+++）胞質呈暗紅色或有粗大紅色顆粒，可出現(xiàn)紅色塊狀。⑤（++++）胞質呈紫紅色或有粗大紅色塊狀。

PAS結果判斷細胞質內有出現(xiàn)紅色顆粒、塊狀111

臨床意義（1）M6與巨幼貧的鑒別

M6的幼紅細胞PAS可呈強陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時PAS反應為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細胞白血病時原單核細胞及幼單核細胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。臨床意義112PAS染色AML-M6幼紅細胞呈陽性反應MA幼紅細胞呈陰性反應PAS染色AML-M6MA113ALL-L1ALL-L1114L1PAS(+)L1PAS(+)115AML-M5AML-M5116M5PAS(+)M5PAS(+)117AML-M6AML-M6118AML-M6PAS(+)AML-M6PAS(+)119AML-M7AML-M7120M7PAS(+)M7PAS(+)121（3）巨核細胞和Sternberg細胞鑒別巨核細胞PAS強陽性，Sternberg細胞為陰性或弱陽性。（4）戈謝氏細胞強陽性，尼曼-皮克細胞陰性或弱陽性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細胞的糖原積分增高；一般的病毒感染，糖原積分在正常范圍內。（3）巨核細胞和Sternberg細胞鑒別122六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：細胞內的氯乙酸AS－D萘酚酯酶（naphytholAS-Dchloroacetateesterase,NAS-DCE）水解基質液中的氯乙酸AS－D萘酚，產生AS－D萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所存在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢紫醬GBC，形成的有色沉淀為紅色。NAS－DCE幾乎僅出現(xiàn)在粒細胞，其特異性高，因此又稱為“粒細胞酯酶”、“特異性酯酶”。六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：123結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)紅色沉淀①（－）胞質無色。②（＋）胞質呈淡紅色。③（＋＋）鮮紅色沉淀布滿胞質。④（＋＋＋）深紅色沉淀充滿胞質。結果判斷陽性結果為胞質內出124

臨床意義1．急性粒細胞白血病和急性早幼粒細胞白血病原粒細胞NAS－DCE染色多呈（＋）~（＋＋）。白血病性早幼粒細胞呈（＋＋）~（＋＋＋）。2．急性單核細胞白血病原、幼單核細胞多呈陰性反應。3．急性淋巴細胞白血病原、幼淋巴細胞呈陰性反應。。臨床意義125七、中性非特異性酯酶染色

原理：中性非特異性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-Dacetateesterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）染色。細胞內的α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）在pH中性的條件下水解基質液中的α-醋酸萘酚，釋放出α-萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色，α-NAE存在于單核細胞、粒細胞和淋巴細胞中，故它是一種中性非特異性酯酶。七、中性非特異性酯酶染色原理：126結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)藍色或棕黑色顆粒沉淀

①（－）無顆粒沉淀，為0分。②（±）顆粒少量、稀疏，為0.5分。③（＋）胞質內1/2區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為1分。④（＋＋）胞質內3/4區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為2分。⑤（＋＋＋）胞質內布滿顆粒沉淀，為3分。⑥（＋＋＋＋）胞質內充滿濃密的顆粒沉淀，為4分。結果判斷陽性結果為胞質內出現(xiàn)127

臨床意義NAS－DAE染色屬于中性非特異性酯酶染色，在鑒別白血病類型時需同時做NaF抑制試驗。

1．急性粒細胞白血病原粒細胞NAS－DAE染色可呈陽性反應，且不被氟化鈉抑制。2．急性早幼粒細胞白血病白血病性早幼粒細胞NAS－DAE染色為陽性或強陽性反應，亦不被氟化鈉所抑制。3．急性單核細胞白血病原、幼單核細胞NAS－DAE染色多呈陽性或強陽性反應，但能被氟化鈉抑制

臨床意義128骨髓NAS-DAE染色及氟化鈉抑制反應

骨髓NAS-DAE染色及氟化鈉抑制反應129骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件130骨髓檢查及細胞化學染色檢驗課件131細胞化學染色檢驗小結細胞化學染色檢驗小結132幾種常見急性白血病的細胞化學染色結果急淋急粒急單紅白血病POX藍黑色－+~+++－~+視合并的白細胞類型而定SB黑棕黑色－++~+++－~+同上AS-DNCE紅－－~+++－~+同上α-NAE棕黑－~++－~+++同上α-NAE-NaF不被NaF抑制被NaF抑制