pcr聚合酶鏈式反應(yīng)課件

第一章PCR技術(shù)原理2021/7/131第一章PCR技術(shù)原理2021/7/131定義：PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction)，是通過模擬體內(nèi)DNA復制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)。PCR技術(shù):2021/7/132PCR技術(shù):2021/7/132PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年獲得諾貝爾獎2021/7/133PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、19引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/7/134引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高溫。2021/7/135技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNAthermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)1988年Saiki等從溫泉（

Hot

spring）中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。2021/7/136thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

①耐高溫，②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。在

1989

年，Science

將PCR中的TaqDNA多聚酶命名為當年的風云分子

(Molecule

of

the

year)

TaqDNA聚合酶優(yōu)點2021/7/137TaqDNA聚合酶優(yōu)點2021/7/1371、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應(yīng)過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR技術(shù)的基本原理和工作方式2021/7/1381、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物2021/7/1310PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/7/1311PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始2021/7/1312PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/7/1313PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束2021/7/1314PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束2021/7/PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增2021/7/1315PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件模板DNA第1輪擴增第2輪擴增3.PCR基本材料

①模板：單鏈或雙鏈DNA

②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶④底物：四種脫氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活劑

2021/7/13163.PCR基本材料2021/7/13164.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)變性（使模板DNA充分變性）⑵94℃30’’變性⑶50-60℃30’’-1’復性（使引物與模板充分退火）⑷72℃n’(按1’擴增1kb計算）延伸⑹72℃3-7’總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35個循環(huán)2021/7/13174.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)5.PCR要素解析1）復性和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定（低于Tm值2-3℃）。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。2）反應(yīng)時間

變性一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

2021/7/13185.PCR要素解析1）復性和延伸溫度2021/7/13185.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底。

2021/7/13195.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)2021/7/13195.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序

最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決非特異性擴增的問題。

2021/7/13205.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序2021/7

5.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：①緩沖液：提供合適的PH值和DNA聚合酶的激活劑10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mM

MgCl2，50mMK+

②dNTP（底物）：等摩爾濃度的4種dNTP（即

dATP、dTTP、dCTP和dGTP），終濃度一般為200mM（即飽和濃度），dNTP的濃度會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和忠實性。

③引物：

1μM/L

2021/7/13215.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：2021/7/135.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。

模板的數(shù)量會直接影響擴增的效果。模板濃度過高會導致反應(yīng)的非特異性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最適反應(yīng)溫度72℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最廣泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前為止錯配率最低的高溫DNA聚合酶。

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2021/7/13225.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。2021/7①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性②引物的解鏈溫度：兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。對于小于20個堿基的引物其Tm值可用簡易公式計算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的3’端）。④G+C含量：盡量控制在40%至60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3‘末端的重復排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC連排。

5.PCR要素解析：引物設(shè)計2021/7/1323①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引6.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2021/7/13246.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。引物引物6.PCR技術(shù)特點1）特異性2021/7/1325引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。

6.PCR技術(shù)特點2021/7/13263）操作簡便易行6.PCR技術(shù)特點2021/7/13264）用途廣泛生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學6.PCR技術(shù)特點2021/7/13274）用途廣泛生命學科6.PCR技術(shù)特點2021/7/131、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次實驗所用材料2021/7/13281、2×TaqPCRMasterMix本次實驗所用材料2PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto252021/7/1329PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMastePCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循環(huán)60℃30sec72℃30sec72℃10min1個循環(huán)4℃hold

2021/7/1330PCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。2021/7/1331瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中2021/7/1332瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中2021/7/1333電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。2021/7/1334分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）線狀DNA分子的有效范圍（Kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.12021/7/1335線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的實驗材料【材料】1.瓊脂糖2.10mg/mlEB3.marker4.TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml2021/7/1336實驗材料【材料】Tris242gCH3COOH57.1ml0實驗步驟【步驟】1、稱1.5g瓊脂糖，加100ml電泳緩沖液（1×TAE）加熱熔化。2、膠液冷卻至60℃時，加入4μlEB，小心混勻，緩慢倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子。3、待膠凝固后，撥出梳子，將模具置于水平電泳槽中，加入1×TAE，讓液面高于膠面至少1mm。4、上樣。5、接通電泳儀電源，1-5V/cm電壓（一般80~100V），開始電泳。6、根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳。切斷電源后，取出凝膠，使用凝膠成像儀進行觀察或拍照。2021/7/1337實驗步驟【步驟】2021/7/1337瓊脂糖凝膠電泳DNA回收2021/7/1338瓊脂糖凝膠電泳DNA回收2021/7/1338實驗原理離心吸附柱純化DNA的原理就是在離心吸附柱內(nèi)使用一種特殊的硅基質(zhì)濾膜，這種濾膜在低PH值、高濃度鹽（鹽酸胍，NaI,NaClO4等）存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會被吸附。再通過一系列漂洗、離心等步驟將殘留的引物、核苷酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。最后用低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈的DNA從濾膜上洗脫下來。利用硅基質(zhì)膜的過濾吸附操作，大大簡化了核酸純化過程，提供了一種快速、高通量的純化方式。除單管離心柱外，已經(jīng)有96孔板、384孔板等核酸純化產(chǎn)品。目前，硅基質(zhì)膜吸附法已經(jīng)成為目前核酸分離純化最主流的技術(shù)。通過該技術(shù)純化的DNA片段可直接用于的酶切、連接、測序、標記和雜交等各種常規(guī)分子生物學操作。2021/7/1339實驗原理離心吸附柱純化DNA的原理就是在離心吸附柱內(nèi)使用一種試劑盒組成及儲存方法名稱用途溶膠/結(jié)合液DA溶膠（紅色）結(jié)合液DD無色與DA混合后變?yōu)辄S色洗滌液W1洗滌液去鹽液W2洗脫鹽離子（75%EtOH）洗脫液EB洗脫DNA吸附柱AC結(jié)合DNA收集管（2ml）收集廢液2021/7/1340試劑盒組成及儲存方法名稱用途溶膠/結(jié)合液DA溶膠（紅色實驗步驟2021/7/1341實驗步驟2021/7/13412021/7/13422021/7/1342注意事項切膠回收DNA時，應(yīng)盡量使用能量較低的長波長紫外線，并縮短操作時間，以減少紫外線對DNA的損傷。第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的無水乙醇，加入后及時做好標記，以免多次加入。各種溶液使用后應(yīng)及時蓋緊，以避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化。所有操作在室溫完成。若溶液沾染皮膚、眼睛時，立即用大量清水沖洗。適當減小洗脫體積可提高回收DNA的濃度。但體積小于30μl將降低洗脫效率。2021/7/1343注意事項切膠回收DNA時，應(yīng)盡量使用能量較低的長波長紫外線，凝膠電泳檢測2021/7/1344凝膠電泳檢測2021/7/1344問題？問題？第一章PCR技術(shù)原理2021/7/1346第一章PCR技術(shù)原理2021/7/131定義：PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction)，是通過模擬體內(nèi)DNA復制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)。PCR技術(shù):2021/7/1347PCR技術(shù):2021/7/132PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年獲得諾貝爾獎2021/7/1348PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、19引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/7/1349引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高溫。2021/7/1350技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNAthermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)1988年Saiki等從溫泉（

Hot

spring）中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。2021/7/1351thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

①耐高溫，②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。在

1989

年，Science

將PCR中的TaqDNA多聚酶命名為當年的風云分子

(Molecule

of

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year)

TaqDNA聚合酶優(yōu)點2021/7/1352TaqDNA聚合酶優(yōu)點2021/7/1371、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應(yīng)過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR技術(shù)的基本原理和工作方式2021/7/13531、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/1354模板DNA95℃2.PCR工作方式2021/7/139PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物2021/7/1355PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2021/7/1356PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件50℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始2021/7/1357PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq2021/7/1358PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束2021/7/1359PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束2021/7/PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增2021/7/1360PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件模板DNA第1輪擴增第2輪擴增3.PCR基本材料

①模板：單鏈或雙鏈DNA

②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶④底物：四種脫氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活劑

2021/7/13613.PCR基本材料2021/7/13164.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)變性（使模板DNA充分變性）⑵94℃30’’變性⑶50-60℃30’’-1’復性（使引物與模板充分退火）⑷72℃n’(按1’擴增1kb計算）延伸⑹72℃3-7’總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35個循環(huán)2021/7/13624.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)5.PCR要素解析1）復性和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定（低于Tm值2-3℃）。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。2）反應(yīng)時間

變性一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

2021/7/13635.PCR要素解析1）復性和延伸溫度2021/7/13185.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底。

2021/7/13645.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)2021/7/13195.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序

最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決非特異性擴增的問題。

2021/7/13655.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序2021/7

5.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：①緩沖液：提供合適的PH值和DNA聚合酶的激活劑10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mM

MgCl2，50mMK+

②dNTP（底物）：等摩爾濃度的4種dNTP（即

dATP、dTTP、dCTP和dGTP），終濃度一般為200mM（即飽和濃度），dNTP的濃度會影響擴增的產(chǎn)量、特異性和忠實性。

③引物：

1μM/L

2021/7/13665.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：2021/7/135.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。

模板的數(shù)量會直接影響擴增的效果。模板濃度過高會導致反應(yīng)的非特異性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最適反應(yīng)溫度72℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最廣泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前為止錯配率最低的高溫DNA聚合酶。

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2021/7/13675.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。2021/7①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性②引物的解鏈溫度：兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。對于小于20個堿基的引物其Tm值可用簡易公式計算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的3’端）。④G+C含量：盡量控制在40%至60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3‘末端的重復排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC連排。

5.PCR要素解析：引物設(shè)計2021/7/1368①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引6.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2021/7/13696.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。引物引物6.PCR技術(shù)特點1）特異性2021/7/1370引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。

6.PCR技術(shù)特點2021/7/13713）操作簡便易行6.PCR技術(shù)特點2021/7/13264）用途廣泛生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學6.PCR技術(shù)特點2021/7/13724）用途廣泛生命學科6.PCR技術(shù)特點2021/7/131、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次實驗所用材料2021/7/13731、2×TaqPCRMasterMix本次實驗所用材料2PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto252021/7/1374PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMastePCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循環(huán)60℃30sec72℃30sec72℃10min1個循環(huán)4℃hold

2021/7/1375PCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。2021/7/1376瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中2021/7/1377瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中2021/7/1378電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。2021/7/1379分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）線狀DNA分子的有效范圍（Kb）0.360~50.620~10.710~0.8