DB37-T 4092-2020 魚(yú)類腸道微生物分離鑒定通用技術(shù)要求

ICS07.100B50

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4092—2020魚(yú)類腸道微生物分離鑒定通用技術(shù)要求20202020082020200920山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋局提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：青島華大基因研究院、青島市標(biāo)準(zhǔn)化研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉姍姍、喬雪松、王裕寬、王萌萌、楊恒加、王琛、陳建威、蘇小珊、翟越、許靜、趙丹。魚(yú)類腸道微生物分離鑒定通用技術(shù)要求范圍GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T30744深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1腸道微生物intestinalmicroorganism生長(zhǎng)于動(dòng)物腸道，并幫助宿主完成多種生理生化功能的微生物群落。3.216SrDNA16SrRNA16SrRNARNA3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增特定的DNA/RNA片段，這種方法可在生物體外進(jìn)行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。3.4Sanger測(cè)序SangersequencingDNADNA19774縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。PBS（PhosphateBufferSaline）PCR（PolymeraseChainReaction）OD：（OpticalDensity）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足GB19489中關(guān)于一級(jí)或以上級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室的要求。24h2216E（A.3）50mL7575PBS10g1g3mLPBS2℃～8100μLPBS100010-1100μL10-1PBS1000μL10-210-3、10-4281～312h10～2002812h～24B150rpm286000.6～1.0之間。對(duì)培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行基因組提取，參照GB/T30744內(nèi)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。16SrDNA對(duì)所提取菌株基因組的16SrDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件詳見(jiàn)附錄C。PCRPCR對(duì)擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，步驟參見(jiàn)附錄D。PCR對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確定分離微生物的種類并參考附錄E的信息記錄表進(jìn)行記錄。8魚(yú)類腸道微生物的保藏菌種保藏參見(jiàn)SN/T2632規(guī)范內(nèi)容。參照附錄E的信息記錄表，對(duì)保藏信息進(jìn)行記錄。附錄A（）表A.1給出PBS配方。表A.1PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g蒸餾水定容至1000mLpH值7.4表A.2給出2216E培養(yǎng)基配方。表A.22216E蛋白胨5g酵母膏1gFePO40.01g陳海水定容至1000mL瓊脂糖（固體培養(yǎng)基添加）15gpH值7.6注：適用海水魚(yú)腸道微生物培養(yǎng)表A.3給出LB培養(yǎng)基配方。表A.3給出LB培養(yǎng)基配方。表A.3LB培養(yǎng)基配方蛋白胨10g酵母膏5gNaCl10g蒸餾水定容至1000mL瓊脂糖（固體培養(yǎng)基添加）15gpH值7.6注：適用淡水魚(yú)腸道微生物培養(yǎng)附錄B（）表B.1給出菌落形態(tài)特征統(tǒng)計(jì)表。表B.1菌落形態(tài)特征統(tǒng)計(jì)表菌種編號(hào)顏色大小形狀質(zhì)地有無(wú)暈圈有無(wú)光澤是否濕潤(rùn)是否凸起是否透明培養(yǎng)時(shí)間記錄人附錄C（規(guī)范性附錄）菌液PCR表C.1給出PCR反應(yīng)引物序列。表C.1PCR引物名稱序列27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492RTACGGCTACCTTGTTACGACTT表C.2給出PCR反應(yīng)體系。表C.2PCR（25μL）組分用量μL無(wú)菌水17.210×PCRBuffer2.5dNTP2.027F1.01492R1.0Taq酶0.3模板（菌液）1.0表C.3給出PCR反應(yīng)時(shí)間。表C.3PCR反應(yīng)時(shí)間溫度時(shí)間循環(huán)945min1個(gè)循環(huán)9430s30個(gè)循環(huán)551min721min7210min1個(gè)循環(huán)4∞1個(gè)循環(huán)附錄D（規(guī)范性附錄）電泳測(cè)試LoadingbufferPCR樣品，DL2000Safe配制1.5（30501004μL/100mLSYBRSafeLoadingbufferPCR2μL3μL3μLMarker120V～200進(jìn)將凝膠電泳放入凝膠成像儀成像觀察。將凝膠電泳放入凝膠成像儀成像觀察。D.4產(chǎn)物驗(yàn)證觀察電泳條帶是否單一、條帶是否明亮、產(chǎn)物大小是否為1500bp左右，若滿足上述要求，則表明PCR成功。對(duì)于沒(méi)有成功的樣品可再次進(jìn)行PCR驗(yàn)證，或?qū)⒈２氐木哼M(jìn)行活化，培養(yǎng)后再次進(jìn)行PCR。附錄E（規(guī)范性附錄）菌株信息記錄表表E.1給出菌株信息記錄表。表E.1菌株信息記錄表魚(yú)種信息魚(yú)種魚(yú)編號(hào)采集日期獲取方式采集地點(diǎn)樣品狀態(tài)保藏人備注菌株16SrDNA鑒定及保藏信息菌株編號(hào)Top-hittaxonTop-hitstrainSimilarity%保藏時(shí)間保藏方式保藏孔位注：魚(yú)種編號(hào)和菌株編號(hào)可根據(jù)自身需要進(jìn)行編制，如：AK1（1號(hào)鮟鱇魚(yú)），2018-AK1-G-001（1號(hào)鮟鱇魚(yú)腸道第一株菌）。參考文獻(xiàn)M].1980.J2016,2016(1):1-8.RoeselersG,MittgeK,StephensWZ,etal.Evidenceforacoregutmicrobiotainthezebrafish[J].IsmeJournal,2011,5(10):1595.LiX,YuY,FengW,etal.Hostspeciesasastrongdeterminantoftheintestinalmicrobiotaoffishlarvae.[J].JournalofMicrobiology,2012,50(1):29-37.張涵,周濤,王巖.綜合養(yǎng)殖池塘中三角帆蚌和魚(yú)類腸道細(xì)菌的組成[J].水生生物學(xué)報(bào),2013(5):824-835.(Scophthalmusmaximus)2014,14(20):3801-3805.王純,倪加加,顏慶云,等.草魚(yú)與團(tuán)頭魴腸道菌群結(jié)構(gòu)比較分析[J].水生生物學(xué)報(bào),2014(5):868-875.SanchezLM,WengRW,RienerRM,etal.ExaminingtheFishMicrobiome:Vertebrate-DerivedBacteriaasanEnvironmentalNichefortheDiscoveryofUniqueMarineNaturalProducts[J].PlosOne,2012,7(5):e35398.from