非洲豬瘟病毒P72單克隆抗體的制備及抗體檢測(cè)方法的建立課件VIP

非洲豬瘟病毒P72蛋白單克隆抗體的制備及抗體檢測(cè)

方法的建立研究生：朱紅導(dǎo)師：孫懷昌教授研究背景是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高致死性的傳染病。強(qiáng)毒株感染的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%，OIE將其列為國(guó)際A類疾病。在非洲國(guó)家廣泛流行。無(wú)有效疫苗進(jìn)行防治。

非洲豬瘟（Africanswinefever）研究背景形態(tài)特征（圖1）復(fù)制方式：胞漿內(nèi)分類：非洲豬瘟病毒科是唯一一種DNA蟲媒病毒非洲豬瘟病毒（ASFV）下一頁(yè)返回有囊膜、二十面體對(duì)稱、雙股DNA病毒；病毒粒子堆積于胞漿中，平均直徑200nm,結(jié)構(gòu)復(fù)雜。中心部為一個(gè)電子密度大的類核體，周圍為清晰的六角形外殼?；蚪M約為170~210kb。研究背景研究背景

VP72參與病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞的四種主要蛋白之一。占病毒粒子蛋白的32%，是一種非常保守的抗原性蛋白,對(duì)自然感染具有免疫原性。是血清學(xué)檢測(cè)的理想抗原。研究目的及意義診斷的意義目前尚無(wú)理想的疫苗對(duì)非洲豬瘟進(jìn)行預(yù)防?？贵w診斷的目的發(fā)病豬產(chǎn)生的IgG抗體在體內(nèi)能持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，特別適用于亞急性和慢性病例的檢出。

單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)特異性強(qiáng)高效，靈敏，便捷，成本低研究?jī)?nèi)容一非洲豬瘟病毒P72單抗的制備技術(shù)路線抗原的制備免疫BALB/c小鼠融合篩選鑒定免疫原的制備重組細(xì)菌pGEX-VP72表達(dá)融合蛋白GST-VP72免疫小鼠SDS電泳定量IPTG誘導(dǎo)切膠、磨膠泳道1：pGEX-VP72未誘導(dǎo)全菌泳道2：pGEX-VP72誘導(dǎo)沉淀M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker。↖↖免疫用蛋白表達(dá)鑒定KD

12M1178549342519檢測(cè)用抗原的制備重組細(xì)菌pGEX-VP72S

表達(dá)GST-VP72S純化GST-VP72S4℃或-20℃保存?zhèn)溆肐PTG誘導(dǎo)GlutathioneSepharose4B

方陣滴定法定量包被96孔反應(yīng)板M：低分子量蛋白質(zhì)marker1：未純化的GST-VP72s2：純化過(guò)的GST-VP72s97664331KDM12M：蛋白質(zhì)預(yù)染Marker泳道1：未誘導(dǎo)的pGEX-VP72S泳道2：IPTG誘導(dǎo)的GST-VP72SM

121178549342519KD←45←45檢測(cè)用抗原的鑒定與純化篩選結(jié)果篩選到五株陽(yáng)性克隆，命名為3E9、3E11、4A8、4H2、6E5。方法GST-VP72sGST抗GST-VP72s陽(yáng)性抗GST陽(yáng)性包被96孔板√×{單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)論：細(xì)胞上清效價(jià)在27~212之間，腹水效價(jià)可達(dá)216。細(xì)胞株上清P/N值效價(jià)3E910.12123E115.7274A83.4274H26.7286E510.5212單克隆抗體的亞類鑒定細(xì)胞上清IgAIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM3E90.2030.2540.1411.20.2150.363E110.1700.2150.1770.8590.2840.4914A80.1940.2590.1980.9150.3050.3224H20.2320.3010.2420.950.2630.386E50.2170.3340.1742.2610.2620.352陰性對(duì)照0.2210.2220.2230.3060.2570.358結(jié)論：經(jīng)亞類試劑盒鑒定，單抗的亞類為IgG2b。單克隆抗體的抗原識(shí)別間接ELISADot-ELISAWesternblotting方法間接ELISA結(jié)果GST-VP72s為抗原一抗OD值P/N3E91.55814.833E111.08510.334A81.21211.544H21.2039.526E51.34612.81陰性血清0.105

GST為抗原一抗OD值P/N3E90.2941.4853E110.1490.7534A80.0670.3384H20.0640.3236E50.1370.692陰性血清0.198結(jié)論：與GST-VP72s抗原反應(yīng)呈陽(yáng)性，與GST抗原反應(yīng)呈陰性。Dot-ELISA結(jié)果1~6：GST-VP72S為抗原，分別以3E9、3E11、4A8、4H2、6E5、陰性血清為一抗；7~12：GST為抗原，分別以3E9、3E11、4A8、4H2、6E5、陰性血清為一抗。

結(jié)論：與GST-VP72S抗原反應(yīng)呈陽(yáng)性，與GST抗原反應(yīng)呈陰性。123456789101112WesternblotM：低分子量蛋白質(zhì)電泳marker1：抗原為復(fù)性的GST-VP722：抗原為純化的GST3：抗原為純化的GST-VP72sM123976643311410045KDiELISA抗體檢測(cè)方法的建立研究?jī)?nèi)容二包被液PBS碳酸鹽緩沖液(pH9.6)0.05MTris-cl(pH8.6)生理鹽水蒸餾水OD值1.3081.2061.3671.4331.0310.7001.2681.2140.4200.520均值1.2571.4000.8651.2410.470抗原包被液的選擇結(jié)論：以碳酸鹽緩沖液（pH9.6）包被效果最好，其次是PBS和生理鹽水，0.05MTris-cl(pH8.6)包被效果較差，蒸餾水包被效果不理想。封閉液包被條件10%小牛血清的PBST5%脫脂乳1%BSA陰性檢測(cè)值P/N陰性檢測(cè)值P/N陰性檢測(cè)值P/N37℃

2h0.2721.0213.750.1951.4677.50.5921.9983.374℃過(guò)夜0.2821.144.040.1981.5147.650.6352.3073.63抗原包被條件及封閉液的選擇結(jié)論：4℃過(guò)夜包被要比37℃2h效果好，但是區(qū)別不是很大。三種封閉液中5%脫脂乳的封閉效果最好?？乖罴严♂尪鹊臏y(cè)定單抗稀釋倍數(shù)2526272829210211212213陰性1001.7651.7641.641.3241.180.8730.6660.490.3480.3512001.7251.5371.5781.2551.0740.840.6090.4530.230.3394001.711.5841.5391.2311.0620.8040.5480.3290.1190.3288001.6181.5611.5051.1671.0310.7560.5340.2910.1710.19816000.7571.491.3191.1640.9170.6270.40.170.1170.082結(jié)論：抗原最佳稀釋度為1：256，單抗工作濃度為1：800，二抗工作濃度為1：1000。單抗稀釋液的選擇單抗稀釋液PBSPBST檢測(cè)值1.131.1221.1721.169均值1.1261.171結(jié)論：兩種稀釋液的效果相近，差別不大。沖洗液PBST（0.5%）PBST（0.1%）0.5MNaCl/PBST（0.5%）0.5MNaCl/PBST（0.1%）PBS檢測(cè)值0.9690.8951.401.471.5511.451.5511.4311.2611.045均值0.9321.431.501.4911.153陰性值0.1390.120.1370.130.10.1030.1140.120.1910.188均值0.1290.1320.1020.1170.19P/N7.221114.712.746.06沖洗液的選擇12345結(jié)論：以0.5MNaCl/PBST（0.5%）作為沖洗液靈敏性最強(qiáng)，PBS效果最差。用純化的VP72S抗原包被板子在同一條件下對(duì)豬瘟病毒，豬繁殖呼吸綜合癥病毒，豬無(wú)名高熱病毒，豬圓環(huán)病毒，細(xì)小病毒等病毒感染血清以及正常豬血清，抗非洲豬瘟病毒陽(yáng)性鼠血清，和模擬發(fā)病豬血清進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)。CSFVPRRSV無(wú)名PCVPPV正常血清模擬血清陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照檢測(cè)值0.1110.0940.0880.0770.0730.1290.3751.3960.1050.0910.0850.080.0750.0760.0760.3951.9420.096均值0.1010.0890.0840.0760.0740.1030.3851.6690.101P/N1.000.880.830.750.731.023.8116.50結(jié)果——————++特異性交叉試驗(yàn)靈敏性試驗(yàn)?zāi)M血清稀釋倍數(shù)×50×100×200×400×800×1600陰性O(shè)D4901.8861.4631.0700.6780.4620.3090.065P/N2922.516.4610.467.14.7結(jié)論：模擬血清稀釋到1600倍仍可以檢測(cè)到陽(yáng)性，說(shuō)明該方法具有較高的靈敏性?？乖话灞４嫫诘臏y(cè)定第10天第20天第30天第40天第50天第60天OD4901.3391.3451.2081.1991.2671.259P/N8.37.98.27.87.87.6

-20℃放置抗原包被板OD值和P/N的變化

4℃放置抗原包被板OD值和P/N的變化

第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天OD4901.4381.4451.3381.3391.351.4011.32P/N9.69.68.98.999.38.8結(jié)論：按此方法包被的酶標(biāo)板在-20℃至少放置60天，在4℃至少放置7天。統(tǒng)計(jì)學(xué)t測(cè)驗(yàn)分析P=0.321≥0.05差異不顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)t測(cè)驗(yàn)分析P=0.190≥0.05差異不顯著小結(jié)獲得