1.1-DNA重組技術(shù)的基本工具(00001)幻燈片

選修3現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題

1專(zhuān)題1基因工程2基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯3技術(shù)發(fā)明使基因工程的實(shí)施成為可能1.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2.工具酶的發(fā)現(xiàn)3.DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4.DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5.重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6.第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世7.PCR技術(shù)的發(fā)明4基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。5

1.1DNA重組技術(shù)的基本工具7基因工程需要哪些基本工具?8培育抗蟲(chóng)棉需要哪些工具？分子手術(shù)刀—限制性核酸內(nèi)切酶分子縫合針—DNA連接酶

分子運(yùn)輸車(chē)—載體9一、分子手術(shù)刀------限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶）1011T磷酸二酯鍵1234512345A12內(nèi)切酶切割DNA后形成的末端——黏性末端、平末端是如何形成的？13什么叫黏性末端？1415什么叫平末端？16大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)形成黏性末端。SmaⅠ能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端。17當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線（圖中虛線）兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端，而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的則是平末端。18限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的。圖1-1限制酶識(shí)別序列的中心軸線19識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的酶。4000種。1、來(lái)源：2、種類(lèi)：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶黏性末端平末端20尋根問(wèn)底:限制酶存在于原核細(xì)胞中的作用是什么？為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？21為什么限制酶不能將自己的DNA分子剪切掉？1、DNA分子不具備該種限制酶的識(shí)別切割序列；2、通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能切開(kāi)。221.原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2.迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來(lái)的，它們各自可以識(shí)別和切斷DNA上特定的堿基序列。細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因?yàn)槲⑸镌陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，對(duì)于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵.23二、ＤＮＡ連接酶——“分子縫合針”１.作用：連接磷酸二酯鍵24限制酶切割后產(chǎn)生兩種不同的末端。那么恢復(fù)它們的連接時(shí)，所用DNA連接酶是否可以不加選擇？E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端２.DNA連接酶的種類(lèi)25DNA連接酶-------“分子縫合針”分類(lèi)E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶差別:

E.coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來(lái),不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接;T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端,又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端,但連接平末端之間的效率比較低。26DNA連接酶——分子縫合針常用類(lèi)型E·coli

DNA連接酶T4

DNA連接酶來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體功能連接黏性末端連接黏性末端和平末端結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵27DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？28答：不是一回事。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。29DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位相同點(diǎn)雙鏈單鏈在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵二者都由蛋白質(zhì)構(gòu)成30假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺(jué)？如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

—“分子運(yùn)輸車(chē)”31載體的必要條件能自我復(fù)制，或能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因位點(diǎn)，以便重組后進(jìn)行篩選對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。大小適中，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。32能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別。33常用的分子運(yùn)輸車(chē)有哪些？質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒3435小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶載體具備的條件自我復(fù)制具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因大小適中質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害36思考與探究總結(jié)規(guī)律限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的。

1.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…（4）…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…你是否能用DNA連接酶將它們連接起來(lái)？372和7能連接形成…ACGT…

…TGCA…；4和8能連接形成…GAATTC…

…CTTAAG…；3和6能連接形成…GCGC…

…CGCG…；1和5能連接形成…CTGCAG…

…GACGTC…。38

3.基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實(shí)不然，作為基因工程使用的載體必需滿(mǎn)足以下條件。（1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。（3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。（4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。（5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。394.網(wǎng)上查詢(xún)：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。401.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶A練習(xí)412.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD423.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（）A、目的基因的獲取B、基因表達(dá)載體的構(gòu)建C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測(cè)與鑒定C練習(xí)43謝謝44問(wèn)題:DNA聚合酶與DNA連接酶是同一種酶的不同名稱(chēng)嗎?相同區(qū)別DNA聚合酶形成磷酸二酯鍵只能將單個(gè)核苷酸連接到核酸片段上;以一條DNA鏈為模板,形成互補(bǔ)的DNA鏈。DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段之是形成磷酸二脂鍵；將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板。45問(wèn)題：標(biāo)記基因的作用及其應(yīng)用標(biāo)記基因抗四環(huán)素的基因抗氨芐青霉素的基因特定顏色的基因四環(huán)素氨芐青霉素46習(xí)題:已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因,現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、寫(xiě)出可能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3結(jié)論結(jié)果一++++既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因結(jié)果二++——只含有抗四環(huán)素基因結(jié)果三+—+—只含有抗氨芐青霉素基因結(jié)果四+———既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因47載體的三大功能：1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的復(fù)制能力或整合力。3）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的擴(kuò)增和表達(dá)能力。理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率。2)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。3)具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合適的選擇標(biāo)記（報(bào)告基因），便于DNA重組分子的檢測(cè)。問(wèn)題:為什么需要載體,直接將基因?qū)胧荏w細(xì)胞行不行?11/7/202248山西省孝義市第二中學(xué)質(zhì)粒的構(gòu)建與改造1)刪除不必要的DNA區(qū)域，縮小分子量，提高外源DNA片段裝載量。2)滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。3)加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。4)加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。一般來(lái)說(shuō)，天然運(yùn)載體往往不能滿(mǎn)足人類(lèi)的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的運(yùn)載體進(jìn)行人工改建。11/7/202249山西省孝義市第二中學(xué)（08海南高考）右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tctR

為四環(huán)素抗性基因，P啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)圖回答。（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連