PNH-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

李智偉第一頁(yè)，共三十七頁(yè)。PNH

(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)是一種罕見(jiàn)的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾病。但近年來(lái)有增多趨勢(shì)。我國(guó)北方多于南方。半數(shù)以上發(fā)生在20-40歲青壯年。男性多于女性，與遺傳及種族無(wú)關(guān)。本病起病隱襲緩慢，呈慢性過(guò)程，以貧血、出血為首發(fā)病癥者較多，以血紅蛋白尿起病者較少。第二頁(yè)，共三十七頁(yè)。第三頁(yè)，共三十七頁(yè)。血紅蛋白尿

睡眠有關(guān)，早晨較重，下午較輕

尿液外觀為醬油或紅葡萄酒樣;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等

第四頁(yè)，共三十七頁(yè)。原因因?yàn)檠a(bǔ)體作用最適宜的pH是6.8～7.O，而睡眠時(shí)呼吸中樞敏感性降低，酸性代謝產(chǎn)物積聚

第五頁(yè)，共三十七頁(yè)。第六頁(yè)，共三十七頁(yè)。研究歷史Strubing第一次報(bào)道PNH

Ham和Dingle證明了PNH患者的紅細(xì)胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就是現(xiàn)在普遍使用的Ham實(shí)驗(yàn)1983年證實(shí)PNH患者GPI合成異常1993年pig-a基因突變第七頁(yè)，共三十七頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)

原理：X染色體上PIG-A〔造血干細(xì)胞經(jīng)獲得性體細(xì)胞基因〕突變導(dǎo)致糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙導(dǎo)致由GPI錨接在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白喪失，包括CD16、CD55、CD59等第八頁(yè)，共三十七頁(yè)。第九頁(yè)，共三十七頁(yè)。GPI錨連接蛋白補(bǔ)體調(diào)接蛋白衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻擊復(fù)合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補(bǔ)體C8結(jié)合蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。

粘附分子淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。第十頁(yè)，共三十七頁(yè)。GPI錨連接蛋白酶類紅細(xì)胞乙酰膽堿脂酶(AchE)、中性粒細(xì)胞堿性磷酶酸酶(NAP)、5’外核酸酶(CD73)。受體類中性粒細(xì)胞III型Fc受體(FcRIIIb或CD16)、單核細(xì)胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(u-PAR)。血型抗原CD55攜帶的Comer抗原、AchE攜帶的Yt抗原。第十一頁(yè)，共三十七頁(yè)。1型細(xì)胞CD59完全陽(yáng)性第十二頁(yè)，共三十七頁(yè)。補(bǔ)體激活途徑C1C1C2,C4C4b2b(C3轉(zhuǎn)化酶〕C3C3bP〔備解素〕PC3bBbC3bB

(C5轉(zhuǎn)化酶〕C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC)CD59替代途徑經(jīng)典途徑CD55Ag-Ab第十三頁(yè)，共三十七頁(yè)。分析1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門(mén) 報(bào)告標(biāo)本中CD55、CD59陰性比例第十四頁(yè)，共三十七頁(yè)。做20~30份正常人血樣劃定陽(yáng)性區(qū)〔Ⅰ區(qū)〕范圍同型陰性對(duì)照界定Ⅲ區(qū)范圍，中間的區(qū)域即為Ⅱ區(qū)。第十五頁(yè)，共三十七頁(yè)。第十六頁(yè)，共三十七頁(yè)。根據(jù)CD59可以將PNH細(xì)胞分為3型1型細(xì)胞CD59完全陽(yáng)性正常細(xì)胞2型細(xì)胞CD59局部陽(yáng)性補(bǔ)體中度敏感細(xì)胞3型細(xì)胞CD59完全陰性補(bǔ)體敏感細(xì)胞第十七頁(yè)，共三十七頁(yè)。第十八頁(yè)，共三十七頁(yè)。第十九頁(yè)，共三十七頁(yè)。第二十頁(yè)，共三十七頁(yè)。CD55和CD59同時(shí)局部或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。CD59重要性大于CD55單CD55缺乏時(shí)并不因此改變紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體的敏感性而造成溶血CD59的缺失會(huì)增加補(bǔ)體的敏感性臨床上以CD59缺失作為診斷標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)趨勢(shì)。解決了一切以補(bǔ)體溶血為根底的實(shí)驗(yàn)診斷方法在診斷PNH的不確定性意義第二十一頁(yè)，共三十七頁(yè)。其它細(xì)胞的PNH檢測(cè)PNH患者的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上GPI錨連膜蛋白局部或全部喪失。粒細(xì)胞>單核細(xì)胞>淋巴細(xì)胞>紅細(xì)胞骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細(xì)胞略早于紅細(xì)胞第二十二頁(yè)，共三十七頁(yè)。其它細(xì)胞的PNH檢測(cè)應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門(mén)分析時(shí)會(huì)有許多脫顆粒的中性粒細(xì)胞，這時(shí)只使用物理特征無(wú)法準(zhǔn)確設(shè)定粒細(xì)胞門(mén)了，這時(shí)必須使用系列標(biāo)志/SSC設(shè)門(mén):CD15，CD33。CD64設(shè)門(mén)，分析單核CD14,CD55,CD59，PNH病人檢測(cè)GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根據(jù)淋巴細(xì)胞上GPI相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)診斷。

第二十三頁(yè)，共三十七頁(yè)。與其他實(shí)驗(yàn)比較1.酸溶血試驗(yàn)(Ham試驗(yàn))患者紅細(xì)胞與含5%鹽酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育2小時(shí)，溶血明顯。本試驗(yàn)特異性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血試驗(yàn)蛇毒因子能通過(guò)補(bǔ)體交替途徑，使補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。本試驗(yàn)特異性強(qiáng)，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗(yàn)。3.熱溶血試驗(yàn)和蔗糖溶血試驗(yàn)

因特異性差，常作為篩選方法。第二十四頁(yè)，共三十七頁(yè)。具有PNH克隆的血液病

檢測(cè)粒細(xì)胞GPI錨連蛋白表達(dá)

病種檢測(cè)例數(shù)缺失例數(shù)(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并發(fā)現(xiàn)MDS有PNH表達(dá)者ATG〔人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白〕治療有效

(AnInternMed1999，131:401)第二十五頁(yè)，共三十七頁(yè)。PNH和AA關(guān)系相當(dāng)密切，可以相互轉(zhuǎn)化且并存AA→PNH較多(15%)，PNH→AA少20%`~30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治療后)→PNH10~31%AA-PNH綜合征16.5%(我國(guó))50%AA外周血或骨髓可檢出PNH克隆AA→PNH生存率要高于PNH→AAMDS-RA如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白)治療有效。PNH對(duì)AA和MDS的“自然治療〞，而“AA救了PNH〞。第二十六頁(yè)，共三十七頁(yè)。PNH克隆見(jiàn)于淋巴增殖性疾病檢測(cè)病種例數(shù)

NHL87HD55紅細(xì)胞CD55/CD59CLL49缺失檢出率9.2%ALL22HCL4

(HematolJ2001，2:33)

第二十七頁(yè)，共三十七頁(yè)。PNH克隆見(jiàn)于漿細(xì)胞病檢測(cè)紅細(xì)胞CD55/CD59缺失

病種檢測(cè)例數(shù)缺失例數(shù)(%)MM626WM72MGUS61HCD21

合計(jì)7710(12.9%)

(IntJHematol2002,75:40)第二十八頁(yè)，共三十七頁(yè)。FLAER嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。1998年Diep等報(bào)道嗜水氣單胞菌(HEC)毒素能特異地與細(xì)胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合，隨后立即聚合成多具體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，在膜上形成孔洞致溶破。PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì)胞完好。第二十九頁(yè)，共三十七頁(yè)。FLAERFLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細(xì)胞上都有特異性表達(dá)，所以正常人及非PNH貧血FLAER成100%陽(yáng)性。是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。FLAER對(duì)PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它靶向標(biāo)記檢出率的敏感性為1%；第三十頁(yè)，共三十七頁(yè)。結(jié)果分析1.設(shè)門(mén)CD45/SSC2.標(biāo)記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER 檢測(cè)PNH粒、單核及淋巴細(xì)胞，報(bào)告標(biāo)本中各系細(xì)胞FLAER陰性比例第三十一頁(yè)，共三十七頁(yè)。第三十二頁(yè)，共三十七頁(yè)。第三十三頁(yè)，共三十七頁(yè)。FLAER目前FLAER一般用于有核細(xì)胞的檢測(cè)，不能評(píng)價(jià)紅細(xì)胞的PNH克隆。由于紅細(xì)胞外表沒(méi)有氣單胞菌溶素前體產(chǎn)生所需要的蛋白水解酶類，盡管表達(dá)在紅細(xì)胞外表的血型糖蛋白不是錨連蛋白，但是由于血型糖蛋白與氣單胞菌溶素前體結(jié)合力較弱，因此限制了FLAER在紅細(xì)胞中的應(yīng)用。第三十四頁(yè)，共三十七頁(yè)。與CD55、CD59比較，F(xiàn)laer對(duì)PNH患者對(duì)中性粒細(xì)胞的測(cè)定最為清晰、準(zhǔn)確臨床上高度疑心，而CD55、CD59不能確診的病例，可以結(jié)合F1aer檢查，獲得明確診斷第三十五頁(yè)，共三十七頁(yè)。謝謝！第三十六頁(yè)，共三十七頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。做20~30份正常人血樣劃定陽(yáng)性區(qū)〔Ⅰ區(qū)〕范圍。CD55和CD59同時(shí)局部或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。本試驗(yàn)特異性強(qiáng)，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗(yàn)。3.熱溶血試驗(yàn)和蔗糖溶血試驗(yàn)因特異性差，常作為篩選方法。PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì)胞完好。謝謝第三十七頁(yè)，共三十七頁(yè)。養(yǎng)素過(guò)量與中毒維生素A可以促進(jìn)生長(zhǎng)、保護(hù)上皮組織，對(duì)防治皮膚干燥、眼干、夜盲癥有一定的作用。超量攝入可導(dǎo)致中毒。人體攝入過(guò)量的維生素A所引起中毒綜合征，稱維生素A中毒。最早報(bào)道于16世紀(jì)90年代,北極探險(xiǎn)者食用了含有大量維生素A的北極熊肝后數(shù)小時(shí)發(fā)生頭痛、嘔吐、嗜睡等癥狀，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)由于濫用維生素A濃縮劑,產(chǎn)生中毒癥狀者也時(shí)有報(bào)道,值得重視。病因成人多為食用含維生素A極高的食物,如鱈魚(yú)、北極熊的肝等；兒童則多因意外服用大劑量維生素A補(bǔ)充劑而引起。

急性維生素A中毒多在食用后3-6小時(shí)發(fā)病。多發(fā)生于一次或多次連續(xù)攝入成人膳食推薦攝入量(RNI)的100倍，或兒童大于其RNI的20倍。臨床表現(xiàn)1.急性中毒：表現(xiàn)為食欲減退、煩躁或嗜睡、嘔吐、前囪膨隆、頭圍增大等。顱內(nèi)壓增高在急性中毒中較常見(jiàn)。

2.慢性中毒：早期出現(xiàn)煩躁、食欲減退、低熱、多汗、脫發(fā)，以后有典型的骨痛癥狀，呈轉(zhuǎn)移性疼痛，可伴有軟組織腫脹，有壓痛點(diǎn)而無(wú)紅、熱征象，以長(zhǎng)骨及四肢骨多見(jiàn)，由于長(zhǎng)骨受骨骺包埋，可導(dǎo)致身材矮小。孕婦維生素A中毒可導(dǎo)致胎兒畸形。

治療：應(yīng)立即停服維生素A。預(yù)防：遵守醫(yī)囑，不可過(guò)量或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間攝入；積極宣傳營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生常識(shí)，改變?yōu)E用維生素A制劑的現(xiàn)象及不良的飲食習(xí)慣。防止醫(yī)源性維生素A中毒的發(fā)生。兒童防治維生素D缺乏性佝僂病應(yīng)采用單純維生素D制劑，避免使用維生素A、維生素D合劑;

孕婦要防止維生素A攝入過(guò)量。我國(guó)制定的維生素A可耐受最高攝入量(UL)3000μgRE。維生素D過(guò)量與中毒病因

短期內(nèi)多次給予大劑量的維生素D治療維生素D缺乏病;維生素D預(yù)防劑量過(guò)大，每日攝入量過(guò)多，或在數(shù)月內(nèi)反復(fù)肌注大劑量的維生素D;誤將其他代謝性骨骼疾病或內(nèi)分泌疾病診斷為維生素D缺乏病而長(zhǎng)期給予以大劑量維生素D治療。維生素D中毒劑量的個(gè)體差異較大，一般小兒每日服用2萬(wàn)-5萬(wàn)IU，連續(xù)數(shù)周或數(shù)月即可發(fā)生中毒；敏感小兒每日服用4000IU，連續(xù)1-3個(gè)月即可中毒。臨床表現(xiàn)患兒服用過(guò)量維生素D制劑后，最早出現(xiàn)的癥狀是食欲減退甚至厭食，煩躁、哭鬧、精神不振，多有低熱?？捎袗盒摹I吐、腹瀉或便秘，逐漸出現(xiàn)煩渴、尿頻、夜尿多，偶有脫水或酸中毒。長(zhǎng)期慢性中毒可致骨髓、腎、血管、皮膚出現(xiàn)相應(yīng)的鈣化，影響體格和智力發(fā)育，嚴(yán)重者可致死。治療對(duì)維生素D中毒要積極治療。第一，應(yīng)立即停服維生素D制劑及鈣劑。第二，避免曬太陽(yáng)，采用低鈣飲食。第三，重癥患者需輸液，服用利尿劑，以加速排出。第四，口服腎上腺皮質(zhì)激素(如氫化可的松)，有利于減弱維生素D的作用，服至血鈣正常為止。凡維生素D中毒癥，全部治療必須在醫(yī)師嚴(yán)格指導(dǎo)下進(jìn)行。預(yù)防全面分析患兒佝僂病的輕重程度，不要僅因出汗多，或有出牙晚、走路遲、煩躁、枕禿、體弱中的一兩項(xiàng)就誤認(rèn)為佝僂病而給予大劑量突擊治療。家長(zhǎng)在給孩子服維生素D制劑時(shí)應(yīng)按醫(yī)生的囑咐，嚴(yán)格掌握預(yù)防或治療用量，服用維生素D期間應(yīng)隨時(shí)觀察孩子服藥后的表現(xiàn)，一般每3個(gè)月測(cè)定血鈣一次，如出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，立即去醫(yī)院就診。兒童保健工作者應(yīng)宣傳切勿濫用維生素D制劑，對(duì)佝僂病的防治應(yīng)強(qiáng)調(diào)經(jīng)常戶外活動(dòng)和接受日光照射，不能因缺鈣而反復(fù)注射維生素D。氟過(guò)量與中毒氟的慢性中毒主要發(fā)生于高氟地區(qū)，稱為地方性氟病，主要造成骨和牙的損害，即所謂氟骨病和氟斑牙，在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、北京、天津、山西、陜西、河南、山東、寧夏、貴州等地均有流行。氟斑牙多見(jiàn)于兒童，隨年齡增長(zhǎng)而病‘情加重；氟骨癥多侵犯成年人，并隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)病率增高、病情加重，性別差異不顯著。地方性氟病的主要發(fā)病因素1.飲用高氟水：病區(qū)分布最廣、患病人數(shù)最多的一型。2.燃煤污染：明火燒含氟高的煤3.食用高氟食品：如食鹽、糧食、茶葉等高氟4.工業(yè)三廢污染臨床表現(xiàn)(一)氟斑牙受損害時(shí)間是恒齒生長(zhǎng)期，到恒齒鈣化后即不再受損害。臨床上分為三型:1.白堊型——牙齒表面失去光澤，粗糙似粉筆，觸之有細(xì)沙感，可呈點(diǎn)狀或線狀，或?yàn)椴灰?guī)則小片;重者可波及牙的整個(gè)表面，非白墓區(qū)呈淡白淺黃色。

2.著色型——表面出現(xiàn)微黃色，逐