分離工程,攀枝花學院

萃?。豪萌苜|在互不相溶的兩相之間分配系數的不同,從而達到分離的目的，使溶質得到純化或濃縮的方法。特點:平衡關系簡單;萃取條件溫和;適用范圍廣泛.良好的溶劑要求:1.有大的萃取容量，單位體積的萃取溶劑能萃取大量的產物.2.有良好選擇性.3.與被萃取的液相互溶度小.4.溶劑的回收再利用容易5.化學穩(wěn)定性好，不易分解，對設備腐蝕性小6.經濟性好,價廉易得7.安全性好，無毒性或毒性低.反萃取就是通過調節(jié)水相條件，將目標產物從有機相轉入水相的萃取操作過程。分配系數定義:分配系數是指溶質在兩相中的總濃度之比，其用于表示溶質的分配平衡關系，乳化定義：乳化是一種液體以微小液滴形式分散于另一種不相混合的液體中的現象乳化形成:乳化現象的產生必需有第三種物質的出現，這種物質就是表面活性劑。在發(fā)酵液中存在的大量蛋白質、磷脂及固體顆粒物質，這些物質（主要是蛋白質和磷脂）起到了表面活性劑的作用。破乳方法:1.發(fā)酵液過濾或沉淀，除去蛋白質和磷脂2.加熱，降低粘度，破壞乳濁液3.稀釋法，降低乳化液濃度4.加電解質，中和乳化劑電性，促其聚沉5.轉型法，加入相反乳化劑使乳濁液轉型萃取操作（1）混合:料液與萃取劑充分混合形成具有很大比表面積的乳濁液.產物自料液轉入萃取劑中.（2）分離:分離或萃取相和萃余相（3）溶劑回收:從萃取相中分離出有機溶劑.影響分配系數因素:1.成相聚合物分子量和濃度的影響；2.鹽的種類和濃度對分配系數的影響;3.pH值;4.溫度分配系數對溫度的變化不敏感液膜萃取-定義:液膜分離是由水溶液或有機溶劑構成的液體薄膜將與之不互溶的液體分隔開來，使其中一側液體中的溶質選擇性地透過液膜進入另一側，從而實現溶質間的分離。液膜萃取-液膜分類:1.乳狀液膜2.支撐液膜3.流動液膜液膜萃取-膜相組成:1.膜溶劑2.表面活性劑3.流動載體（萃取劑）液膜萃取-影響液膜萃取的因素：1.pH值2.流速3.共存雜質4.反萃相5.操作溫度6.萃取操作時間反膠團萃取-反膠團的若干定義:1.臨界膠團濃度,表面活性劑在水溶液中開始聚集形成膠束所需要的最小濃度，稱為臨界膠團濃度2反膠陞表面活性劑在有機溶劑中形成的膠團稱為反膠團反膠團萃取-影響分配的因素:1.有機相助溶劑2.表面活性劑和助表面活性劑3.鹽的種類4.臨界點超臨界流體:在臨界點以上的物質處于既非液體也非氣體的超臨界狀態(tài)，稱為超臨界流體。超臨界流體萃取操作：1.等溫法；2.等壓法；3.吸附（吸收）法；超臨界流體萃取的優(yōu)點：1.萃取速度高于液體萃取；2.能耗低于一般的精餾法；3.傳熱速率快，溫度易于控制；4.臨界CO2流體常態(tài)下是氣體，無毒；5.壓力和溫度都可以成為調節(jié)萃取過程的參數；6超臨界流體的極性可以改變，可選擇范圍廣.影響萃取的因素：1.表面活性劑2.水相的pH值3.離子強度4.溫度5.蛋白質的分子量和濃度反膠團萃取是利用表面活性劑在有機溶劑中形成反向膠團，對蛋白質實現有效萃取的一種分離技術影響液膜萃取的主要因素有：1.pH;2.攪拌速度,影響乳化液的分散和液膜的穩(wěn)定性;3.共存雜質,會使目標物質的透過能量下降；4.反萃相，反萃相組成和濃度影響萃取速度和選擇性。5.操作溫度，一般在常溫下進行；6.萃取操作時間；吸附：溶質從液相或氣相轉移到固相的過程。利用固體吸附的原理從液體或氣體中除去有害成分或分離回收有用目標產物的過程稱為吸附操作。吸附種類：物理吸附、化學吸附、離子交換吸附分離介質：按吸附劑的孔道結構區(qū)分---多孔性介質凝膠型介質舉例：吸附劑；活性炭，硅膠，氧化鋁，硅藻土，大網格聚合物吸附劑；離子交換劑，也稱離子交換樹脂。離子交換樹脂由三部分組成：不溶性的三維空間網狀結構構成的樹脂骨架；與骨架相連的功能基團；與功能基團所帶電荷相反的可移動的離子。分類：1陰離子交換劑：可交換陰離子，活性基團為堿性。如有機胺。2陽離子交換劑：可交換陽離子，活性基團為酸性。如羧基和磺酸基。穿透曲線：吸附過程中吸附柱出口溶質濃度的變化曲線稱為穿透曲線。一般將出口濃度達到入口濃度5-10%的時間稱為穿透時間。操作達到穿透點后，繼續(xù)進料對增加吸附量的效果不大，而且出口溶質濃度迅速增大，造成目標產物的損失。這時，應停止進料吸附操作，順次轉入雜質清洗，吸附溶質洗脫和吸附劑再生操作。膨脹床吸附：膨脹床是液固相返混程度較低的液固流化床。同時兼顧了固定床和流化床的優(yōu)點，又克服了兩者的一些缺陷膨脹床：1吸附劑床層比固定化床孔隙率高，允許菌體細胞或細胞碎片自由通過?？芍苯犹幚砭w發(fā)酵液或細胞勻漿液，回收其中的目標產物，從而可節(jié)省離心或過濾等預處理過程，提高目標產物收率，降低分離純化成本。2吸附劑粒子基本懸浮于固定位置，液體的流動與固定床相似，接近平推流，吸附效率高。3要求吸附劑有一定粒徑或密度分布，可形成穩(wěn)定膨脹床。多糖包埋石英晶體、玻璃微球，磁性粒子等。對介質的要求：1有一定密度，能夠呈穩(wěn)定的流化狀態(tài)；2介質與料液中固形顆粒間有明顯差異；3有良好孔道結構，不易被污染；4應具有活性基團，可以進行修飾提高目標產物的吸附容量；5有較好化學穩(wěn)定性和機械強度，使用壽命長；6有良好的傳質性能，在較高流速下，可以保持較高的吸附量。流化床：優(yōu)點：壓降小，可處理高黏度或含固體微粒的粗料液。操作方式同膨脹床。但不需特殊的吸附劑，設備結構也比膨脹床簡單，操作簡便。缺點：床內固相和液相的返混劇烈，吸附劑的利用效率遠低于固定床和膨脹床。色譜原理與分類原理：層析是根據混合物中，溶質在互不混溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法分類：1流動相與固定相：氣相色譜法、液相色譜法、超臨界流體色譜法；2固定相的形狀：液相色譜、紙色譜、薄層色譜、柱色譜；3分配機理：凝膠過濾層析，離子交換層析，疏水性層析，反相層析，親和層析壓力：低壓（壓力低于0.5MPa）,中壓（壓力為0.5~4MPa）,高壓（壓力4~40MPa）蛋白質分離一般為中低壓，介質相對較軟，分析多用高壓層析，介質多為硬質硅膠等。分離度（分辨率）：表達兩種洗脫曲線相鄰的溶質相互分離的程度。分離度隨理論板數的增加而增大。凝膠過濾色譜：凝膠過濾層析也稱體積排阻色譜，一般利用凝膠粒子（通常稱為凝膠過濾介質）為固定相，根據料液中溶質相對分子質量的差別進行分離的液相層析法。-大分子不能進入凝膠中，只從床層空隙流過，洗脫體積為層析柱的空隙體積V0。-小分子能進入凝膠所有細孔中，其洗脫體積接近柱體積Vt。-其它分子洗脫體積介于V0和Vt之間。-且一種凝膠只能對介于V0和Vt之間的分子進行分離。-料液處理量很小。當料液體積小于兩種溶質的洗脫體積差時，兩種溶質才能得到完全分離。色譜介質要求：1親水性高，表面惰性；介質與溶質之間不發(fā)生化學和物理相互作用；2穩(wěn)定性強，在較寬的pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；3具有一定的孔徑分布范圍，即孔徑分布范圍窄；4機械強度高，允許較高的操作壓力（流速）。葡聚糖系列：葡聚糖系列是由葡聚糖（由葡萄糖經a-1,6糖苷鍵連接而成的線性高分子）經環(huán)氧氧丙烷交聯而成的珠狀凝膠。交聯度越高，凝膠孔徑越小。瓊脂糖系列：以P-D-半乳糖和3,6-脫水-aL-半乳糖為基本單位構成的線性多糖。聚丙烯酰胺系：是由丙烯酰胺與N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的一類親水性凝膠。凝膠特性參數-排阻極限：指不能擴散到凝膠網格內部的最小分子的相對分子質量。相對分子質量大于該數值的分子不能進入到凝膠網格中，不能有效分離，洗脫體積為V0。-分級范圍：能為凝膠阻滯且相互間可以得到分離的溶質的相對分子質量范圍。-溶脹率：干膠顆粒用水進行溶脹處理，每克干凝膠所吸收水分的百分數稱為溶脹率。-凝膠粒徑：一般為球形，粒徑大小對分離度有重要影響。粒徑越小，理論塔板高度越小，分離維越高。一般用篩目或微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為50~150頃（100~200目），硬凝膠粒徑較小，一般為5~50pm。粒徑越小，操作壓降越高。-床體積：即1g干燥凝膠溶脹后所占有的體積?？捎糜诠浪阊b滿一定體積的層析柱所需的干燥凝膠量。-空隙體積：指層析柱中凝膠之間空隙的體積，即V0?？障扼w積可用相對分子質量大于排阻極限的溶質測定，一般使用相對分子質量為2000KD的水溶性藍色葡聚糖。影響分離特性的因素-線塑：流速增大會提高理論塔板當量高度，降低分離效果。-料液體積：與分離度有關，一般在不影響分離度的情況下取最大值。-料液濃度：由于與流動相的粘度差，料液濃度高時洗脫曲線容易出現不對稱性質。-分子量與分配系數的關系：選擇分級范圍相對較小的介質，可提高分離度和處理量。-凝膠粒徑：粒徑越小，理論塔板當量高度越小。高效液相介質粒徑小的原因?？商岣卟僮髁魉?，但介質需耐壓。離子交換色譜:利用離子交換介質為固定相，根據荷電溶質和離子交換介質之間的靜電相互作用力的差別進行溶質分離的洗脫層析法。不同溶質在離子交換介質上的分配行為不同，可以在洗脫過程中彼此得到分離。疏水性相互作用色譜:利用表面偶聯弱疏水性基團（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，是根據蛋白質與疏水性介質之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質生物大分子分離純化的洗脫層析法。親和色譜:利用親和吸附作用分離純化生物物質的液相色譜法。親和色譜所用的固定相為鍵合親和配基的親和吸附介質（親和吸附劑）影響親和作用的因素1.離子強度2.pH3.抑制氫鍵形成的物質4.溫度5.離液離子6.螯合劑酶的抑制劑:蛋白酶均存在抑制其活性的物質，稱為酶的抑制劑。它的分布很廣，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制劑（結合常數為109L/mol），也有小分子化合物如氨基芐脒（結合常數為4x104L/mol）?？贵w:抗體和抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數在107~1012L/mol蛋白A（或稱A蛋白）:A蛋白為分子量42kDa的蛋白質，存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁中。它與動物免疫球蛋白G（IgG）具有很強的結合作用。凝集素：凝集素是與糖特異性結合的蛋白質的總稱。在這種蛋白質上具有糖的結合位點?？勺鳛槎嗵恰⑻堑鞍椎群巧锓肿拥呐浠?。輔酶和磷酸酰苷：各類脫氫酶和激酶需要在輔酶存在下表現出其生物催化活性。輔酶和脫氫酶之間有親和作用。三嗪類色素：這類色素與NAD的結合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能與脫氫酶、血清白蛋白、干擾素、核酸酶、溶菌酶等發(fā)生結合作用過渡金屬離子：Cu2+等過渡金屬離子可與蛋白質表面的組氨酸的咪唑基發(fā)生親和結合作用。Cu2+等過渡金屬離子與N、O和S等供電原子產生配位鍵。肝素：存在于動物肝臟等器官中的酸性多糖類物質，分子量為5到30kDa，它與凝血蛋白質、脂蛋白等有親和作用。親和色譜親和色譜介質應滿足條件:1.具有親水性多孔結構，無非特異性吸附；2.物理和化學穩(wěn)定性高，有較高的機械強度3.含有可活化的反應基團4.粒徑均一的球形粒子親和色譜-間隔臂的作用：1當配基分子量較小時，為了排除空間位阻作用，需要在配基和載體之間連接一個“間隔臂”；2間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱親和色譜-影響親和吸附的因素親和膜：親和膜是利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。親和沉淀：親和沉淀是生物親和作用與沉淀分離相結合的蛋白質類生物大分子的分離技術，包括一次作用親和沉淀和二次作用親和沉淀。一次作用親和沉淀原理：1水溶性化合物偶聯多個配基，蛋白質表面含有兩個以上親和結合位點；2化合物與蛋白質因親和作用產生親和交聯；3交聯形成的交聯網絡因分子量較大而沉淀二次作用親和沉淀原理：1利用在物理場改變時溶解度下降，發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和沉淀介質；2親和介質結合目標分子后，通過改變物理場使介質與目標分子共同沉淀包涵體形成原因：1使用高劑量基因和強啟動子；2大腸桿菌細胞質環(huán)境條件；3缺少蛋白質正確折疊的輔助因子；4超表達產生的高濃度新生蛋白質由于多肽鏈不完全折疊，有利于分子疏水序列之間的相互作用，最終導致這些蛋白質的聚集和錯誤折疊。包涵體對分離純化的影響：有利方面：1.蛋白質表達量高；2.抗剪切和較高溫度，對破碎細胞的方法和條件要求低；3.包涵體密度大，易分離；4包涵體的蛋白質純度較高；5.后續(xù)蛋白質分離純化較容易。不利方面：1.需變性復性；2.活性蛋白質收率低。蛋白質的復性一個有效、理想的折疊復性方法應具備以下特點：1.活性蛋白質回收率高；2.正確復性產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；3.折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品；4.折疊復性方法易放大；5.復性過程耗時少。就工業(yè)應用，要求折疊復性過程要快速、低成本、高效。雖然蛋白質折疊復性方法很多，但就某種蛋白質仍需通過實驗確定最佳方法和條件。目前發(fā)展的復性方法：稀釋復性；透析、透濾復性；分子伴侶指導復性；色譜法復性：凝膠過濾色譜復性、離子交換色譜復性、疏水色譜復性、親合色譜復性；反膠團復性；雙水相復性稀釋復性法這是目前最簡單的蛋白質復性方法。將少量的變性蛋白質溶液以一定比例滴加到復性緩沖液中，達到降低變性劑濃度的目的，使處于變性伸展狀態(tài)的蛋白質分子在溶液中自發(fā)地折疊成天然的活性結構。為獲得好的復性結果，必須進行復性條件優(yōu)化。因復性原理不清楚，只能通過實驗來確定。一般可采用正交法。影響復性的條件主要有：變性蛋白質溶液組成及濃度、復性緩沖液的組成(離子種類、氧化還原試劑、螯合劑X離子強度、pH、氧化還原電位、復性溫度、稀釋倍數、混合方式速度等。透析復性法由于變性劑均為小分子物質，在透析或超濾時可逐漸透過多孔膜，使變性蛋白質溶液的變性劑濃度逐漸降低，最后除去變性劑，達到使變性蛋白質折疊復性的目的。影響透析和透濾復性的因素與稀釋復性復性基本相同。但過程緩慢，耗時間長，效率低。色譜復性法在色譜過程中實現復性，稱為色譜復性法。其優(yōu)點是：1色譜固定相對變性蛋白質吸附能力低，甚至完全消除變性蛋白質在脫離變性劑的環(huán)境發(fā)生聚集，產生沉淀。提高復性質量和活性收率。2在蛋白質復性的同時可使目的蛋白質與雜蛋白質分離，達到復性與純化同時進行的目的。3便于回收變性劑，有利于降低廢水處理成本。適合蛋白質復性的色譜有：凝膠過濾色譜(GFC)、離子交換色譜(IEC)、疏水色譜(HIC)、親合色譜(AFC).凝膠過濾復性：凝膠過濾色譜是以溶液中分子的流體力學體積大小進行混合物分離的技術。優(yōu)點：溶質分子之間及溶質與分離介質之間無相互作用，活性分子不易變性，活性收率高。凝膠過濾復性在凝膠過濾復性時，先用復性緩沖液平衡凝膠柱，變性蛋白質溶液上樣后進入柱頂，因有高濃度變性劑存在，變性蛋白質有一個隨機構象狀態(tài)和大的動力學水合半徑，不能進入介質內空隙，在柱上不能保留。在用復性緩沖液洗脫時，因變性蛋白質溶液逐步被稀釋（色譜峰擴散），變性劑和蛋白質濃度降低，蛋白質分子會自發(fā)地向熱力學穩(wěn)定的低能態(tài)，即蛋白質的天然狀態(tài)轉化，使蛋白質開始復性隨時間推移，當蛋白質分子結構變得更加緊密時，蛋白質在兩相中的分配系數會逐漸增加。蛋白質進入介質顆粒內部空隙后，其擴散速度減緩，從而限制了蛋白質的聚集，減少了沉淀產生。蛋白質分子大，先從柱子上洗脫，變性劑分子小，最后流出色譜柱。達到復性目的。超臨界流體萃?。豪贸R界流體作萃取劑，從液體或固體中萃取出某些成分并進行分離的技術?；竟に嚵鞒蹋河奢腿。–O2溶解組分）和分離（CO2和組分的分離）兩步組成。包括高壓泵及流體系統、萃取系統和收集系統三個部分超臨界CO2流體萃取的優(yōu)點：1、CO2的臨界溫度接近于室溫，適合于熱敏性物質，完整保留生物活性，而且能把高沸點，低揮發(fā)度，易熱解的物質分離出來。2、CO2的臨界壓力適中，目前工業(yè)水平易達到；3、CO2的臨界密度是常用超臨界溶劑中最高的（合成氟化物除外），即溶解能力較好；4、CO2無毒、無味、不燃、不腐蝕、價廉，易于精制、易于回收，無污染。電泳：荷電的膠體粒子在電場中的移動；電泳的大致分類:依據電泳原理:移動界面電泳;區(qū)帶電泳;穩(wěn)態(tài)電泳.凝膠電泳凝膠電泳的支持介質：1聚丙烯酰胺凝膠:由丙烯酰胺和交聯劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成；2瓊脂糖凝膠：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1,3連接的P-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水a-D吡喃半乳糖交替形成的；凝膠電泳原理:1在凝膠電泳過程中，不同分子量的荷電溶質在遷移過程中的泳動速度是不同的。2相對分子量較大的溶質受凝膠阻滯作用較大，泳動速度慢；相反，分子量小的溶質泳動速度較快。3經過一定時間的電泳后，根據溶質相對分子質量的不同，凝膠中形成數條含不同溶質的區(qū)帶，實現溶質間的分離。4凝膠電泳所使用的凝膠種類和濃度根據待分離料液中溶質的相對分子量而異。5凝膠電泳中凝膠濃度和pH值均一。毛細管電泳和電色譜:在電場中，毛細管內的電解質因其荷電性質而發(fā)生電泳，同時在水溶液中，石英毛細管內表面的硅羥基解離而帶負電荷，誘導管內產生電滲流。特點1.儀器簡單、易自動化;2.分析速度快、分離效率高;3.操作方便、消耗少;4.進樣量極少，水介質中進行；5.應用范圍極廣主要的膜分離法：微濾，超濾，反滲透:壓差.透析:濃差.電滲析:電位差.滲透氣化:壓差，溫差對膜材料要求:1.起過濾作用的有效膜厚度小，超濾和微濾膜的開孔率高，過濾阻力??；2.膜材料惰性，不吸附溶質，從而使膜不易污染，膜孔不易堵塞；3.適用的pH和溫度范圍廣，耐高溫滅菌，耐酸堿清洗劑，穩(wěn)定性高，使用壽命長；4.容易通過清洗恢復透過性能；5.滿足實現分離目的的各種要求.膜組件型式：管式、中空纖維式、平板式和卷式。影響膜分離速度的因素:1.操作形式a.終端過濾b.錯流過濾2.流速，流速增大，透過通量亦增大。3.壓力4.料液濃度，透過通量隨料液濃度增大而減小。膜污染主要原因：凝膠極化；溶質在膜表面的吸附層；膜孔堵塞；膜孔內的溶質吸附。分離度:兩個相鄰洗脫峰之間的距離與兩個峰寬的代數平均值之比。影響萃取操作的因素1.水相物理條件的影響:a.pH值b.溫度c.無機鹽濃度2,萃取劑的影響3,乳化和破乳4有機溶劑的影響凝膠過濾色譜::利用凝膠粒子為固定相，根據料液中溶質相對分子質量的差別進行分離的液相層析法。凝膠過濾色譜:一般利用凝膠粒子（通常稱為凝膠過濾介質）為固定相，根據料液中溶質相對分子質量的差別進行分離的液相層析法。色譜:根據混合物中，溶質在互不混溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法。色譜介質要求：1,親水性高，表面惰性；2.穩(wěn)定性強;3.具有一定的孔徑分布范圍；4,機械強度高.色譜法分類：1,流動相與固定相a,氣相色譜法b.液相色譜法c.超臨界流體色譜法2,固定相的形狀a.紙色譜b.薄層色譜c柱色譜3,壓力a.低壓b.中壓c.高壓凝膠特性參數:1,排阻極限2,分級范圍3,溶脹率4,凝膠粒徑5,床體積6,空隙體積影響分離特性的因素:1,線速度2,料液體積3,料液濃度4,分子量與分配系數的關系5,凝膠粒徑凝膠過濾色譜的優(yōu)缺點：優(yōu)點：1,恒定洗脫法洗脫，操作條件溫和，產品收率高2,每批操作結束不需進行介質清洗和再生，容易實施循環(huán)操作，提高產品純度3.脫鹽手段，比透析法速度快，精度高；比超濾法剪切力小，蛋白活性收率高4分離機理簡單，操作參數少。缺點：1僅根據分子量大小差別進行分離，選擇性低，處理量小2洗脫后，產品被稀釋。色譜聚焦：基于離子交換的原理，根據兩性電解質分子間等電點的差別進行分離純化的洗脫層析法。疏水性相互作用色譜:利用表面偶聯弱疏水性基團（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，是根據蛋白質與疏水性介質之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質生物大分子分離純化的洗脫層析法。反相色譜:利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為