PCR技術(shù)及臨床應(yīng)用新冠病毒核酸檢測(cè)原理教學(xué)文案課件

1PCR技術(shù)及臨床應(yīng)用、新冠病毒核酸檢測(cè)原理1PCR技術(shù)及臨床應(yīng)用、新冠病毒核酸檢測(cè)原理目錄核酸基本知識(shí)PCR的發(fā)展史PCR技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR的臨床應(yīng)用新冠病毒核酸檢測(cè)原理目錄核酸基本知識(shí)一、核酸基本知識(shí)

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標(biāo)志核酸的分類：脫氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的區(qū)別在于：DNA所含的戊糖為脫氧核糖，而RNA所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。核苷酸：是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸水解首先得到的是單核苷酸，后者可進(jìn)一步水解為核苷和磷酸，核苷可進(jìn)一步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿和嘧啶堿）。一、核酸基本知識(shí)

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命核酸的基本結(jié)構(gòu)核酸的基本結(jié)構(gòu)遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則DNA的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行半保留復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。DNA的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)，開(kāi)啟了分子生物學(xué)時(shí)代，極大地推動(dòng)了核酸生物化學(xué),分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)等各類生命科學(xué)的迅速發(fā)展。1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、PCR污染少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(t第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增

用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個(gè)裝有PCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，與自動(dòng)化基因擴(kuò)增儀相比，它無(wú)須升降溫過(guò)程，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，試驗(yàn)更接近理想PCR反應(yīng)條件。第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增

用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將第二代：自動(dòng)化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)大等不足。且無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。第二代：自動(dòng)化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷，并對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，1992年誕生了所謂“第三代PCR"的熒光定量實(shí)時(shí)PCR。

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結(jié)果依賴于Ct值，在這個(gè)意義上所謂的“定量”也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字PCR"應(yīng)運(yùn)而生。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結(jié)果依賴于C三、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過(guò)程稱為變性。變性后的DNA通過(guò)降溫可以重新接合為雙鏈，這一過(guò)程稱為復(fù)性。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，它的特異性取決于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。三、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過(guò)利用溫度的升降來(lái)控制DNA的變性和復(fù)性。設(shè)計(jì)引物作為啟動(dòng)序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）等原料完成特定基因的體外復(fù)制。周而復(fù)始的升降溫度進(jìn)行擴(kuò)增，每一循環(huán)可以使靶序列增加一倍。利用溫度的升降來(lái)控制DNA的變性和復(fù)性。PCR擴(kuò)增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA的含量既增加一倍。PCR擴(kuò)增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在PCR擴(kuò)增示意圖PCR擴(kuò)增示意圖30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.Ampli常用的ＰＣＲ技術(shù)定性ＰＣＲ電泳檢測(cè)、放射自顯影特異性差、易污染、只能定性ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ特異性較好，極易污染、定量不準(zhǔn)確終點(diǎn)法熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，定量線性范圍小，重復(fù)性不好實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，線性寬重復(fù)性較好常用的ＰＣＲ技術(shù)定性ＰＣＲ四、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置，PCR擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測(cè)，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。四、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)熒光PCR的原理熒光PCR的原理實(shí)時(shí)熒光PCR常用的三個(gè)概念

擴(kuò)增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強(qiáng)度的曲線，定量PCR儀每次PCR擴(kuò)增都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度的變化熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，儀器可自動(dòng)計(jì)算，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。Ct值：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR常用的三個(gè)概念

擴(kuò)增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線示意圖

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖Ct值的意義Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增Ct值與濃度不同濃度的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同Ct值的意義Ct值與重復(fù)性Ct值與濃度PCR擴(kuò)增的理論模式Y(jié)n=X*(1+E)n

，0≤E≤1，E為擴(kuò)增效率,X為原始模板數(shù),Y為PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量,n為周期數(shù)。模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。PCR擴(kuò)增的理論模式Y(jié)n=X*(1+E)n，0≤E≤1，E標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立梯度稀釋后，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線間距相等，標(biāo)準(zhǔn)曲線上的間距也相等，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說(shuō)明梯度稀釋時(shí)操作誤差太大，建議重新做標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋，重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直到擴(kuò)增曲線之間的間距相等為止。因?yàn)檫@一步直接影響著樣品中目的基因原始模板量的準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立梯度稀釋后，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線間距相等，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)快速簡(jiǎn)便應(yīng)用范圍廣實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的特點(diǎn)靈敏度高五、實(shí)時(shí)熒光PCR的臨床應(yīng)用

感染性疾病的診斷母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學(xué)鑒定早期診斷病情評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)新藥驗(yàn)證五、實(shí)時(shí)熒光PCR的臨床應(yīng)用

感染性疾病的診斷感染性疾病的診斷

1.病原體含量與病情之間的關(guān)系

2.病原體含量與用藥之間的關(guān)系

3.藥物及療法的研究與開(kāi)發(fā)

4.新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn)

5.新的愈后指標(biāo)

6.傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測(cè)與預(yù)防感染性疾病的診斷1.病原體含量與病情之間的關(guān)系六、新冠病毒核酸檢測(cè)原理

對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab及編碼核衣殼蛋白N或E基因的特異性保守序列為靶區(qū)域，進(jìn)行了雙靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì)，配以PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)樣本新型冠狀病毒RNA的檢測(cè)。

六、新冠病毒核酸檢測(cè)原理

對(duì)新型冠狀病毒（201PCR技術(shù)及臨床應(yīng)用新冠病毒核酸檢測(cè)原理教學(xué)文案課件此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！

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核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標(biāo)志核酸的分類：脫氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的區(qū)別在于：DNA所含的戊糖為脫氧核糖，而RNA所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。核苷酸：是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸水解首先得到的是單核苷酸，后者可進(jìn)一步水解為核苷和磷酸，核苷可進(jìn)一步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿和嘧啶堿）。一、核酸基本知識(shí)

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命核酸的基本結(jié)構(gòu)核酸的基本結(jié)構(gòu)遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則DNA的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行半保留復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。DNA的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)，開(kāi)啟了分子生物學(xué)時(shí)代，極大地推動(dòng)了核酸生物化學(xué),分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)等各類生命科學(xué)的迅速發(fā)展。1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、PCR污染少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(t第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增

用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個(gè)裝有PCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，與自動(dòng)化基因擴(kuò)增儀相比，它無(wú)須升降溫過(guò)程，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，試驗(yàn)更接近理想PCR反應(yīng)條件。第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增

用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將第二代：自動(dòng)化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)大等不足。且無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。第二代：自動(dòng)化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷，并對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，1992年誕生了所謂“第三代PCR"的熒光定量實(shí)時(shí)PCR。

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結(jié)果依賴于Ct值，在這個(gè)意義上所謂的“定量”也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字PCR"應(yīng)運(yùn)而生。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結(jié)果依賴于C三、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過(guò)程稱為變性。變性后的DNA通過(guò)降溫可以重新接合為雙鏈，這一過(guò)程稱為復(fù)性。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，它的特異性取決于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。三、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過(guò)利用溫度的升降來(lái)控制DNA的變性和復(fù)性。設(shè)計(jì)引物作為啟動(dòng)序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）等原料完成特定基因的體外復(fù)制。周而復(fù)始的升降溫度進(jìn)行擴(kuò)增，每一循環(huán)可以使靶序列增加一倍。利用溫度的升降來(lái)控制DNA的變性和復(fù)性。PCR擴(kuò)增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA的含量既增加一倍。PCR擴(kuò)增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在PCR擴(kuò)增示意圖PCR擴(kuò)增示意圖30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.Ampli常用的ＰＣＲ技術(shù)定性ＰＣＲ電泳檢測(cè)、放射自顯影特異性差、易污染、只能定性ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ特異性較好，極易污染、定量不準(zhǔn)確終點(diǎn)法熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，定量線性范圍小，重復(fù)性不好實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，線性寬重復(fù)性較好常用的ＰＣＲ技術(shù)定性ＰＣＲ四、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置，PCR擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測(cè)，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。四、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)熒光PCR的原理熒光PCR的原理實(shí)時(shí)熒光PCR常用的三個(gè)概念

擴(kuò)增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強(qiáng)度的曲線，定量PCR儀每次PCR擴(kuò)增都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度的變化熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，儀器可自動(dòng)計(jì)算，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。Ct值：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR常用的三個(gè)概念

擴(kuò)增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線示意圖

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖Ct值的意義Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增Ct值與濃度不同濃度的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同Ct值的意義Ct值與重復(fù)性Ct值與濃度PCR擴(kuò)增的理論模式Y(jié)n=X*(1+E)n

，0≤E≤1，E為擴(kuò)增效率,X為原始模板數(shù),Y為PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量,n為周期數(shù)。模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)