端粒端粒酶教案課件

會(huì)計(jì)學(xué)1端粒端粒酶第1頁(yè)/共143頁(yè)會(huì)計(jì)學(xué)1端粒端粒酶第1頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段重復(fù)串聯(lián)的DNA序列與端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；端粒具有穩(wěn)定染色體,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長(zhǎng)而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降并導(dǎo)致衰老。第2頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由

端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸－蛋白復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的RNA為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定性。許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、癌變、凋亡、衰老。

第3頁(yè)/共143頁(yè)端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。第3頁(yè)/第4頁(yè)/共143頁(yè)第4頁(yè)/共143頁(yè)●端粒的發(fā)現(xiàn)

1938MullerX-rayDrosophila

末端極少發(fā)生缺失和倒位推測(cè)染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為T(mén)elomere

1938B.McClintock

頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。推測(cè)染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。七十年代端粒分子組成確定八十年代端粒酶的發(fā)現(xiàn)九十年代端粒酶與細(xì)胞衰老、癌癥的關(guān)系二零零九年諾貝爾獎(jiǎng)第5頁(yè)/共143頁(yè)●端粒的發(fā)現(xiàn)1938Muller末端極少發(fā)生缺失和伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第6頁(yè)/共143頁(yè)伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第6端粒的結(jié)構(gòu)與功能第7頁(yè)/共143頁(yè)端粒的結(jié)構(gòu)與功能第7頁(yè)/共143頁(yè)第8頁(yè)/共143頁(yè)第8頁(yè)/共143頁(yè)ChromosomeDNAGene1Gene2TelomeresTelomeresTTAGGG第9頁(yè)/共143頁(yè)ChromosomeDNAGene1Gene2Telom第10頁(yè)/共143頁(yè)第10頁(yè)/共143頁(yè)1.端粒的組成

端粒DNA與端粒結(jié)合蛋白端粒DNA

重復(fù):

端粒DNA由高度重復(fù)短核苷酸序列組成。人：-TTAGGG-重復(fù)序列

保守：為不含功能基因的簡(jiǎn)單、高度重復(fù)序列,

在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。不同物種的端粒DNA序列存在差異。人類(lèi)及其它脊椎動(dòng)物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是5′TTAGGG3′的重復(fù)序列。體細(xì)胞的端粒有限長(zhǎng)度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細(xì)胞，青年人的TRFs又顯著長(zhǎng)于年長(zhǎng)者，提示TRFs隨著細(xì)胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。第11頁(yè)/共143頁(yè)1.端粒的組成第11頁(yè)/共143頁(yè)

端粒DNA由兩條互相配對(duì)的DNA單鏈組成,其雙鏈部分通過(guò)與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)TRF1和TRF2結(jié)合共同組成t環(huán)(tloops)。這種t環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在。端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體的一頂“帽子”，它既可保護(hù)染色體不被降解，又避免了端粒對(duì)端融合（end-endfusion）以及染色體的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞“分裂時(shí)鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。

第12頁(yè)/共143頁(yè)端粒DNA由兩條互相配對(duì)的DNA單鏈組成,第13頁(yè)/共143頁(yè)第13頁(yè)/共143頁(yè)端粒DNA的長(zhǎng)度：

端粒DNA的平均長(zhǎng)度因物種而異。

端粒DNA的長(zhǎng)度總是波動(dòng)變化，隨遺傳或營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)而改變。人體中，隨細(xì)胞分裂，會(huì)緩慢縮短。Telomerelength第14頁(yè)/共143頁(yè)端粒DNA的長(zhǎng)度：端粒DNA的平均長(zhǎng)度因物種而異。

端粒DNA重復(fù)序列T四膜蟲(chóng)，酵母，植物，蠶，人第15頁(yè)/共143頁(yè)第15頁(yè)/共143頁(yè)端粒結(jié)合蛋白第16頁(yè)/共143頁(yè)端粒結(jié)合蛋白第16頁(yè)/共143頁(yè)

與端粒DNA上的特異序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)稱(chēng)為端粒結(jié)合蛋白。

人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(Telomericrepeatfactor，TRF)，包括TRF1和TRF2。

TRF1通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制端粒增長(zhǎng)，穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度，其并不抑制端粒酶(telomerase)的表達(dá)而是抑制它在端粒末端的行為第17頁(yè)/共143頁(yè)與端粒DNA上的特異序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)稱(chēng)為端粒結(jié)合

TRF1，是一個(gè)60kD的蛋白，結(jié)合同源二聚體雙鏈TTAGGG重復(fù)序列，包含一個(gè)C端螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋區(qū)和一個(gè)DNA結(jié)合折疊同源區(qū)，N端是酸性區(qū)。第18頁(yè)/共143頁(yè)第18頁(yè)/共143頁(yè)

TRF2，與TRF1相似，但N端堿性強(qiáng)?？梢苑乐谷旧w末端相互融合。兩種蛋白在體外都專(zhuān)一與雙鏈TTAGGG重復(fù)序列結(jié)合，在體內(nèi)則位于端粒。人該環(huán)DNA與TRF1、TRF2結(jié)合，TRF2參與T環(huán)形成?！癟環(huán)”保護(hù)3’端對(duì)抗雙鏈破壞的核酸酶作用。）第19頁(yè)/共143頁(yè)TRF2，與TRF1相似，但N端堿性強(qiáng)?？梢苑乐谷旧wTelomereT-loop第20頁(yè)/共143頁(yè)TelomereT-loop第20頁(yè)/共143頁(yè)第21頁(yè)/共143頁(yè)第21頁(yè)/共143頁(yè)第22頁(yè)/共143頁(yè)第22頁(yè)/共143頁(yè)第23頁(yè)/共143頁(yè)第23頁(yè)/共143頁(yè)第24頁(yè)/共143頁(yè)第24頁(yè)/共143頁(yè)2.端粒的功能第25頁(yè)/共143頁(yè)2.端粒的功能第25頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能第26頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能第26頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，第27頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，第27頁(yè)/共143頁(yè)

在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測(cè)生殖細(xì)胞之所以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險(xiǎn)。因此在正常人體細(xì)胞間永生化細(xì)胞（immortalizedcells）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能也存在著與生殖細(xì)胞類(lèi)似的機(jī)制。這些細(xì)胞怎樣保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每次分裂而縮短，但也會(huì)被新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們興奮的是到1984年首先在四膜蟲(chóng)中證實(shí)了這種能使端粒延長(zhǎng)的酶—端粒酶的存在。

第28頁(yè)/共143頁(yè)第28頁(yè)/共143頁(yè)

端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體,由RNA和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成,是RNA依賴(lài)的DNA聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過(guò)明顯的模板依賴(lài)方式每次添加一個(gè)核苷酸。

端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶

端粒酶RNA(hTR)

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）

第29頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶的結(jié)構(gòu)第29頁(yè)/共143頁(yè)

1、端粒酶RNA(hTERT)

哺乳動(dòng)物端粒酶RNAs(hTR)在許多組織的不同發(fā)育階段,甚至那些沒(méi)有端粒酶活性的組織中廣泛表達(dá)。體內(nèi)端粒酶RNA的存在對(duì)端粒酶功能至關(guān)重要，影響到端粒酶RNA的穩(wěn)定性與突變,也可改變體內(nèi)端粒長(zhǎng)度，并可通過(guò)改變端粒完整性或端粒結(jié)合因子的末端結(jié)合位點(diǎn)致細(xì)胞核分裂后期細(xì)胞死亡。端粒酶RNA轉(zhuǎn)錄模板遠(yuǎn)端區(qū):參與和底物的結(jié)合。近端區(qū):能添加特定的核苷酸,對(duì)底物識(shí)別并不重要。模板邊界區(qū):與端粒酶催化亞基TERT結(jié)合,也與端粒酶相關(guān)因子Est1p和Ku結(jié)合。第30頁(yè)/共143頁(yè)1、端粒酶RNA(hTERT)第30頁(yè)/共143頁(yè)TelomeraseRNAThetemplateregionMainTERT-bindingregionTemplateboundaryelement(TBE)TRE,TemplaterecognitionelementLowaffinityTERTbindingsitesAnnu.Rev.Biochem2006,75:493-517第31頁(yè)/共143頁(yè)TelomeraseRNAThetemplatereg2、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerasereversetranscriptase,TERT)

幾乎所有存在端粒酶的機(jī)體均含有一單獨(dú)的TERT基因,哺乳動(dòng)物TERT的轉(zhuǎn)錄由許多轉(zhuǎn)錄因子、激素和細(xì)胞外信號(hào)嚴(yán)格控制。不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)hTERT在不同的細(xì)胞內(nèi)含物中的表達(dá)。癌基因c-myc是一個(gè)受特殊信號(hào)調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因,并可與H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT等癌基因協(xié)同作用,促進(jìn)細(xì)胞無(wú)限增殖,獲得永生化并發(fā)生癌變。第32頁(yè)/共143頁(yè)2、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerasereverset人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

（humanTelomeraseReverseTranscriptase(TERT),）

TERTgene:3396bp,

protein:

1131氨基酸殘基CrystalStructureoftheEssentialN-terminal

ofthetelomerasereversetranscriptase(TEN)C-terminaldomainofTERTNaturestructureal&molecularbiology2006,13:218-225第33頁(yè)/共143頁(yè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（humanTelomeraseRev

c-myc與hTERT

Fujimoto等用c-myc反義寡核甘酸轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞后,這些細(xì)胞中端粒酶活性均能被下調(diào),而c-myc正義寡核甘酸無(wú)此作用。

Wang等研究發(fā)現(xiàn)c-myc在正常人乳腺上皮細(xì)胞和二倍體成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)端粒酶活性,并能延長(zhǎng)這些細(xì)胞的壽命。因此認(rèn)為癌基因c-myc為一重要的端粒酶激活劑。

存在于hTERT核心啟動(dòng)子中有兩個(gè)重要的c-myc結(jié)合位點(diǎn)(CACGTG,亦被稱(chēng)為E盒)。c-myc誘導(dǎo)的hTERT表達(dá)起始速度快,不受細(xì)胞增殖或額外的蛋白合成的影響,與c-myc引起的直接的轉(zhuǎn)錄激活一致。但癌基因c-myc不是唯一與hTERT基因調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。第34頁(yè)/共143頁(yè)c-myc與hTERT第34頁(yè)/共143頁(yè)

近期研究表明,Sp1協(xié)同c-myc激活hTERT的轉(zhuǎn)錄,可能還有其他因子,如Bcl-2抗凋亡基因、E6HPV16型蛋白，以及經(jīng)過(guò)一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT上調(diào)。但在諸多不同類(lèi)型的瘤細(xì)胞中,致hTERT上調(diào)的基本激活劑是c-myc。

TERT內(nèi)的N-殘基對(duì)多種功能是重要的,包括與端粒酶RNA結(jié)合、端粒酶RNA裝配和催化作用、與p53的相互作用和細(xì)胞永生化。

TERT的C-殘基也在人類(lèi)原始纖維母細(xì)胞的永生化、端粒組裝的競(jìng)爭(zhēng)、核仁內(nèi)定位、引物結(jié)合和漸進(jìn)性延長(zhǎng)等方面起重要作用。

第35頁(yè)/共143頁(yè)近期研究表明,Sp1協(xié)同c-myc激活hTERT3、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP)⑴端粒酶相關(guān)蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA結(jié)合蛋白，TEP1缺失導(dǎo)致rRNA水平的顯著降低以及TEP1和rRNA的丟失,但不導(dǎo)致端粒酶活性或端粒長(zhǎng)度的紊亂。⑵生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN)產(chǎn)物熱休克蛋白（hsp）90、其他涉及到TERT轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白包括磷酸酶-A、Akt、cAbl、p53和PARP。PinX1與人TERT體外共表達(dá)時(shí)抑制人端粒酶活性。⑶芽殖酵母蛋白Est1p和Est3p這兩個(gè)蛋白與體內(nèi)端粒酶的功能有關(guān)。Est1p足以使端粒延長(zhǎng)。但是,在無(wú)Est1p存在的情況下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以維持端粒長(zhǎng)度。第36頁(yè)/共143頁(yè)3、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP)第36頁(yè)/共14人端粒酶RNA(humanTelomeraseRNA(hTRorTERC).hTR:451nt,

第37頁(yè)/共143頁(yè)人端粒酶RNA(humanTelomeraseRNATelomeraseiscomposedofbothRNAandprotein第38頁(yè)/共143頁(yè)TelomeraseiscomposedofbothTelomeraseTelomeraseisaspecializedreversetranscriptase,containsbothRNAandProteinScience1997,276:561-567第39頁(yè)/共143頁(yè)TelomeraseTelomeraseisa第39頁(yè)/端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶RNA是第一個(gè)被克隆的端粒酶組分。端粒酶RNA含有與同源端粒DNA序列TTAGGG的互補(bǔ)序列,核糖核酸酶H切割此模板區(qū),能使體外消除端粒酶延長(zhǎng)端粒的功能。人類(lèi)TERT（hTERT）基因?yàn)橐粏慰截惢?定位于5p15.33,具有7個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T。破壞TERT將消除端粒酶活性并致端?？s短。TEP1、生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN)產(chǎn)物、hsp90

、PinX1、Est1p和Est3p

第40頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋第41頁(yè)/共143頁(yè)第41頁(yè)/共143頁(yè)第42頁(yè)/共143頁(yè)第42頁(yè)/共143頁(yè)THEENDREPLICATIONPROBLEM

TELOMERASEIfcellsdon'thavetelomerase,whathappenswithtelomeresaftermanycellsdivisions?第43頁(yè)/共143頁(yè)THEENDREPLICATIONPROBLEM

第44頁(yè)/共143頁(yè)第44頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶延長(zhǎng)端粒DNA

第45頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶延長(zhǎng)端粒DNA第45頁(yè)/共143頁(yè)Inchwornmodel第46頁(yè)/共143頁(yè)Inchwornmodel第46頁(yè)/共143頁(yè)第47頁(yè)/共143頁(yè)第47頁(yè)/共143頁(yè)TelomereT-loop第48頁(yè)/共143頁(yè)TelomereT-loop第48頁(yè)/共143頁(yè)Telomeresarepackagedintoauniquestructure--aT-loop第49頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresarepackagedintoaGreen=Telomere-specificproteinsT-loopseenintheelectronmicroscope第50頁(yè)/共143頁(yè)Green=T-loopseen第50頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresStructuralelementsofaeukaryoticchromosome(5')(TxGy)n(3')(AxCy)nTheTxGystrandintelomeresfoldsbackuponitself,formingGquadruplexes.Metalion(K+)bindingisrequiredtoformastablestructure.第51頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresTheTxGystrandinteTelomeres

Structuralelementsofaeukaryoticchromosome(5')(TxGy)n

(3')(AxCy)nJ.MolBiol.(2002),320,911-924第52頁(yè)/共143頁(yè)Telomeres

StructuralelementsTelomeresJ.MolBiol.(2002),320,911-924第53頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresJ.MolBiol.(2002),第54頁(yè)/共143頁(yè)第54頁(yè)/共143頁(yè)第55頁(yè)/共143頁(yè)第55頁(yè)/共143頁(yè)

端粒酶活性的測(cè)定

端粒酶的特殊性使端粒酶活性的測(cè)定在研究中顯得尤為重要?；緶y(cè)定方法是通過(guò)測(cè)定細(xì)胞提取物將端粒重復(fù)片段加到一個(gè)合成的寡聚脫氧核苷酸引物3′端的能力進(jìn)行的。（1）TRAP法模擬端粒結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)單鏈DNA引物TS，端粒酶催化加上6核苷酸重復(fù)序列，然后用重復(fù)序列互補(bǔ)引物CX對(duì)合成產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，電泳差6ntDNA條帶。早期方法，只能定性。（2）TRAP-同位素圖譜上述反應(yīng)體系加入32P標(biāo)記ATP，32P-TS引物，PCR擴(kuò)增后電泳，放射自顯影，掃描定量。第56頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶活性的測(cè)定端粒酶的特殊性使端粒酶活性（3）TRAP-非同位素圖譜組織裂解液稀釋?zhuān)琓RAP法分析，溴乙錠染色根據(jù)6bp梯形條帶在高低濃度出現(xiàn)，半定量分析。（4）PCR-ELISA法按TRAP法延伸引物，PCR擴(kuò)增，與地高辛標(biāo)記重復(fù)序列探針雜交，雜交產(chǎn)物通過(guò)生物素標(biāo)記引物固定于抗生物素包被微孔板上，過(guò)氧化酶結(jié)合地高辛抗體檢測(cè)PCR產(chǎn)物。產(chǎn)生有色產(chǎn)物，定量。（5）PCR-熒光法用熒光標(biāo)記引物TS和CX，進(jìn)行TRAP延伸、PCR、電泳。熒光分析定量。進(jìn)行TRAP延伸、PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合能選擇結(jié)合雙鏈DNA的超敏熒光染料，測(cè)定電泳熒光強(qiáng)度，分析產(chǎn)生DNA量與端粒酶活性正比。半定量。第57頁(yè)/共143頁(yè)（3）TRAP-非同位素圖譜第57頁(yè)/共143頁(yè)

端粒及端粒酶與衰老的關(guān)系第58頁(yè)/共143頁(yè)端粒及端粒酶第58頁(yè)/共143頁(yè)

端?？s短是觸發(fā)衰老的分子鐘。大多數(shù)正常體細(xì)胞中不能檢測(cè)到端粒酶的活性。端粒隨細(xì)胞分裂每次丟失50-200個(gè)堿基。Cooke等認(rèn)為，正常體細(xì)胞中端粒酶未被活化，導(dǎo)致端粒DNA縮短?？赡茏罱K制約細(xì)胞增殖能力。幾千個(gè)堿基的端粒DNA丟失后，細(xì)胞就停止分裂而衰老。最有力的證據(jù)是Bodnar等的工作。將人端粒酶基因?qū)胝＜?xì)胞，使端粒酶異常表達(dá)。端粒序列異常延長(zhǎng)，細(xì)胞旺盛增殖，壽命大大延長(zhǎng)。

第59頁(yè)/共143頁(yè)第59頁(yè)/共143頁(yè)第60頁(yè)/共143頁(yè)第60頁(yè)/共143頁(yè)TelomereLength(humans)NumberofDoublings2010Cellular(replicative)SenescenceNormalSomaticCells(TelomeraseNegative)Telomerealsoprovideameansfor"counting"celldivision:telomeresshortenwitheachcycleTelomeresshortenfrom10-15kb(germline)to3-5kbafter50-60doublings(averagelengthsofTRFs)Cellularsenescenceistriggeredwhencellsacquireoneorafewcriticallyshorttelomeres.第61頁(yè)/共143頁(yè)TelomereLength(humans)Number第62頁(yè)/共143頁(yè)第62頁(yè)/共143頁(yè)第63頁(yè)/共143頁(yè)第63頁(yè)/共143頁(yè)第64頁(yè)/共143頁(yè)第64頁(yè)/共143頁(yè)第65頁(yè)/共143頁(yè)第65頁(yè)/共143頁(yè)第66頁(yè)/共143頁(yè)第66頁(yè)/共143頁(yè)第67頁(yè)/共143頁(yè)第67頁(yè)/共143頁(yè)端?？s短可引發(fā)細(xì)胞老化的機(jī)制可能有3種情況①端粒DNA的縮短釋放了端粒結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，該因子進(jìn)而激活衰老誘導(dǎo)基因或滅活細(xì)胞周期進(jìn)行所必需的某些基因；②誘導(dǎo)DNA損傷的反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻；③端粒的縮短引起免疫功能下降，Pommier”早在1997年就觀察到，受HIV感染的高度免疫缺陷病人外周血單核細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度急劇縮短。第68頁(yè)/共143頁(yè)端粒縮短可引發(fā)細(xì)胞老化的機(jī)制可能有3種情況①端粒DNA的縮大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，端粒、端粒酶與衰老之間存在相關(guān)性。①在多數(shù)體細(xì)胞中，老年個(gè)體的端粒長(zhǎng)度較年輕個(gè)體短的多，某些細(xì)胞如T、B淋巴細(xì)胞中的端粒酶活性隨年齡的增加而下降。②年輕個(gè)體細(xì)胞中端粒酶活性隨年齡的增長(zhǎng)而下降。③需要無(wú)限分裂能力的譜系細(xì)胞、干細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)，且具有較高的端粒酶活性；而大多數(shù)具有有限增生能力的體細(xì)胞的端粒較短，不表達(dá)活性?xún)H低度表達(dá)端粒酶活性。④增生能力強(qiáng)的細(xì)胞及永生細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性，即使同一組織的不同部分，其分裂能力也與端粒酶的活性呈正比。⑤端粒酶陰性的細(xì)胞在引入端粒酶后，可維持端粒的長(zhǎng)度，細(xì)胞增生能力加強(qiáng)，甚至細(xì)胞永生化第69頁(yè)/共143頁(yè)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，端粒、端粒酶與衰老之間存在相關(guān)性。第69TelomereLengthDeclines035651,5003,0008,000Age(years)Telomerelengthinbasepairs(humanwhitebloodcells)第70頁(yè)/共143頁(yè)TelomereLengthDeclines035651第71頁(yè)/共143頁(yè)第71頁(yè)/共143頁(yè)Telomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.細(xì)胞分裂端粒閾值第72頁(yè)/共143頁(yè)Telomeraseactivityisrepress

長(zhǎng)短細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長(zhǎng)短呈正比細(xì)胞分裂端粒閾值端粒長(zhǎng)短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測(cè)胎兒細(xì)胞株嬰兒細(xì)胞株青年細(xì)胞株老年細(xì)胞株年齡小大端粒長(zhǎng)度早老性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（記時(shí)器）丟失的速率/年，預(yù)測(cè)人類(lèi)的壽命

XXXYwhy?PCD機(jī)制、癌細(xì)胞的無(wú)限繁殖第73頁(yè)/共143頁(yè)長(zhǎng)短細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長(zhǎng)短呈正比細(xì)胞分裂端Inmostsomatictissues,telomeraseisexpressedatverylowlevelsornotatall--ascellsdivide,telomeresshortenTelomeraseandSenescenceShorttelomeresmaybeasignalforcellstosenesce(stopdividing)第74頁(yè)/共143頁(yè)Inmostsomatictissues,telom

在早老患者中有一個(gè)過(guò)早的端?？s短，進(jìn)而縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患者的細(xì)胞中或培養(yǎng)的老化細(xì)胞中染色體組型衰老異常的高發(fā)生率密切相關(guān)。既然端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，使端粒在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中不會(huì)丟失，細(xì)胞衰老的進(jìn)程也能被阻止，從而壽命延長(zhǎng)——這正是人們研究的端粒酶與抗衰老關(guān)系的新熱點(diǎn)。第75頁(yè)/共143頁(yè)在早老患者中有一個(gè)過(guò)早的端粒縮短，進(jìn)而縮短的端粒允許

端粒酶延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度以減慢細(xì)胞衰老最早的證據(jù)來(lái)自Bodnar等的研究，1998年其在Science上刊文報(bào)道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細(xì)胞中激活其表達(dá)并培養(yǎng)細(xì)胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長(zhǎng)，細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞壽命比后者大大延長(zhǎng)，更令人關(guān)注的是細(xì)胞并無(wú)腫瘤樣改變。Kudo等報(bào)道端粒酶活性和細(xì)胞凋亡可作為伴有或不伴有子宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤(pán)衰老的標(biāo)志。第76頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度以減慢細(xì)胞衰老最早的證據(jù)來(lái)自Bod

Mattson等亦認(rèn)為在研究神經(jīng)細(xì)胞分化和存活中激活端粒酶與TERT功能，能較好地避免神經(jīng)細(xì)胞死亡，還可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在各種神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復(fù)。阿爾茨海默病（Alzheimer`sdisease，AD）是一種常見(jiàn)于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，其患者的腦血管壁中可分離出致AD神經(jīng)元退行性病變的?-淀粉樣蛋白。

Zhu等利用反義技術(shù)和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由?-淀粉樣蛋白肽引起的細(xì)胞凋亡；嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中TERT的過(guò)量表達(dá)會(huì)降低此種細(xì)胞凋亡。

第77頁(yè)/共143頁(yè)Mattson等亦認(rèn)為在研究神經(jīng)細(xì)胞分化和存活中激活其原因是TERT功能降低的神經(jīng)細(xì)胞在暴露于?-淀粉蛋白中能增強(qiáng)其氧化性并使線粒體功能發(fā)生障礙，因而引起細(xì)胞凋亡。TERT在神經(jīng)退行性病變實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓宫F(xiàn)出有神經(jīng)保護(hù)性功能，提示在神經(jīng)細(xì)胞中若能提高端粒酶的活性可能會(huì)抑制與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性病變，如AD和腦老化的發(fā)生等。第78頁(yè)/共143頁(yè)其原因是TERT功能降低的神經(jīng)細(xì)胞在暴露于?-淀粉蛋白中能增

端?？s短加快可在許多病變中觀察到:如Down綜合征、Werner綜合征、毛細(xì)管擴(kuò)張失調(diào)癥、先天性角化不良等,雖然有些遺傳異常和端粒缺陷的關(guān)系還不清楚,但可能的原因有:①端粒核酸外切酶活性和(或)有效利用的增加。②端粒過(guò)度丟失。③在發(fā)育或出生后端粒補(bǔ)償機(jī)制的不足(端粒酶或正性ALT樣功能)。端?？s短加速可由于環(huán)境的應(yīng)急介導(dǎo)的DNA損害或?qū)@些損害敏感度增加所致。不管何種原因,端?？s短速率增加可致增殖組織的早衰特征,但也促進(jìn)由于致瘤突變而獲得增殖活性提高的克隆過(guò)分生長(zhǎng)。

第79頁(yè)/共143頁(yè)端粒縮短加快可在許多病變中觀察到:如Down綜合第80頁(yè)/共143頁(yè)第80頁(yè)/共143頁(yè)第81頁(yè)/共143頁(yè)第81頁(yè)/共143頁(yè)

細(xì)胞的死亡過(guò)程分為兩個(gè)階段,當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長(zhǎng)度2-4kb時(shí),染色體的穩(wěn)定性就會(huì)遭到破壞,細(xì)胞開(kāi)始衰老進(jìn)入M1期（mortalitystage1M1）。在M1期細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（cellcyclecheckpoints）發(fā)送周期停止信號(hào)，DNA合成停止，DNA斷裂,活化p53依賴(lài)或非p53依賴(lài)的DNA損傷途徑。并誘導(dǎo)CDK抑制物如p21,p27產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞G1期生長(zhǎng)停滯,最終走向死亡。如果這一過(guò)程中一些癌基因SV40T抗原、PRB,或p53,p16等抑癌基因失活,喪失正常功能,

均能使M1期的機(jī)制被抑制使細(xì)胞逃逸M1期，繼續(xù)生長(zhǎng)獲得額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過(guò)20-30次分裂后，最終到達(dá)M2期。細(xì)胞由于端粒過(guò)短,基因不穩(wěn)定,絕大多數(shù)細(xì)胞死亡,只有極少數(shù)細(xì)胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活,端粒的功能得到恢復(fù),基因重獲穩(wěn)定,使細(xì)胞超越M2期,成為永生化細(xì)胞。

第82頁(yè)/共143頁(yè)細(xì)胞的死亡過(guò)程分為兩個(gè)階段,當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長(zhǎng)第83頁(yè)/共143頁(yè)第83頁(yè)/共143頁(yè)

端粒酶被抑制正常人體細(xì)胞端粒丟失

M1期阻滯SV40T抗原細(xì)胞分裂停止Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變

↓

M1—M2期間隔永生化雙著絲粒形成

↓

M2期退化染色體失穩(wěn)端粒酶被激活

細(xì)胞凋亡

端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化中第84頁(yè)/共143頁(yè)

端粒、端粒酶與腫瘤第85頁(yè)/共143頁(yè)端粒、端粒酶與腫瘤第85頁(yè)/共143頁(yè)

端粒酶活化是腫瘤的顯著特征

盡管有研究認(rèn)為端粒長(zhǎng)度維持還可以借助于非端粒酶依賴(lài)模式，即端粒替代延長(zhǎng)（altematireLengtheningoftelomereALT）機(jī)制，但其存在上并不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中端粒酶的重要作用。自從1994年Kim等創(chuàng)立TRAP法檢測(cè)端粒酶活性以來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類(lèi)原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到。美國(guó)學(xué)者在400多例來(lái)源于12種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽(yáng)性率高達(dá)84.8％，而腫瘤周?chē)M織或良性病變中陽(yáng)性率僅為4.4％。第86頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶活化是腫瘤的顯著特征第86頁(yè)/共143頁(yè)

附表人體組織中端粒酶活性腫瘤部位/類(lèi)型與腫瘤鄰近正常組織/良性病變腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）結(jié)腸0/45（0）22/23（95.6%）肝——1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經(jīng)母細(xì)胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）——21/23（91.3%）腦——6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合計(jì)14/332（4.2%）365/430(84.8)第87頁(yè)/共143頁(yè)附表人體組織中端粒酶活性腫瘤第88頁(yè)/共143頁(yè)第88頁(yè)/共143頁(yè)

Shay等報(bào)道了幾年不同學(xué)者對(duì)腫瘤端粒酶探討的檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)了正常組織（196例），原位癌（410例），惡性腫瘤（2031例）和癌旁組織（690例）的端粒酶的陽(yáng)性率，它們分別是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽(yáng)性率為85.0%～95.0%，而對(duì)應(yīng)的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。Sumida等的研究結(jié)果表明,端粒酶在各種腫瘤中的陽(yáng)性率分別為:口腔鱗狀細(xì)胞癌80%～90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.1%,肝癌85%,乳腺癌85%,腎癌71%,胰腺癌95%,端粒酶陽(yáng)性率與腫瘤發(fā)生之間表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。

第89頁(yè)/共143頁(yè)Shay等報(bào)道了幾年不同學(xué)者對(duì)腫瘤端粒酶探討的檢測(cè)結(jié)

Orlando等對(duì)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行了深入的流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為69%(345/497),正常腎組織為2%(7/344);膀胱癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為90%(342/381),正常組織為27%(36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶陽(yáng)性率為65%(436/675),膀胱灌洗液中端粒酶陽(yáng)性率為72%(131/182),而正常人為9%(47/486);前列腺癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為80%(266/332),鄰近組織為38%(32/83),前列腺上皮瘤為16%(4/25),良性前列腺肥大為8%(11/129)。

第90頁(yè)/共143頁(yè)Orlando等對(duì)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行了深入

85%～90%的人腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到端粒酶活性,而正常細(xì)胞中卻沒(méi)有或活性很低。人們推測(cè)腫瘤細(xì)胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端粒維持機(jī)制改變的結(jié)果。一般認(rèn)為,端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)后期事件,使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮短而得以維持,避免了細(xì)胞正常的復(fù)制-衰亡機(jī)制的制約而獲得永生性,這是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生物學(xué)特征之一,是癌變機(jī)制中一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。第91頁(yè)/共143頁(yè)85%～90%的人腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到端粒酶

對(duì)細(xì)胞端粒功能的觀察和推測(cè)的最顯著的特征是發(fā)生端粒長(zhǎng)度的維持,甚至在離開(kāi)常規(guī)的激活時(shí)端粒長(zhǎng)度維持機(jī)制(TMM)的延長(zhǎng),使初期細(xì)胞突破衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因,最可能為過(guò)度的端粒酶激活在細(xì)胞癌變中端粒長(zhǎng)度的保留或增加,允許在致瘤突變發(fā)生時(shí)異?？寺〉臄U(kuò)展。一些端粒酶陰性的癌癥通過(guò)一種或幾種ALT途經(jīng)維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶或ALT機(jī)制存在于絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中以通過(guò)添加端粒重復(fù)序列而維持端粒的長(zhǎng)度。在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象，可能的機(jī)制是由于細(xì)胞分裂的增加端?？s短，導(dǎo)致異常修復(fù)事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的后果是在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生染色體斷裂,進(jìn)而導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。

第92頁(yè)/共143頁(yè)對(duì)細(xì)胞端粒功能的觀察和推測(cè)的最顯著的特征是發(fā)生端粒第93頁(yè)/共143頁(yè)第93頁(yè)/共143頁(yè)第94頁(yè)/共143頁(yè)第94頁(yè)/共143頁(yè)

以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究

在85%以上的腫瘤細(xì)胞和組織中高度表達(dá)端粒酶，因此端粒酶是一個(gè)較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。(1)使用端粒酶抑制劑后,腫瘤細(xì)胞端?？s短直至足以對(duì)增殖產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng),這種時(shí)間上的滯后與起始端粒的長(zhǎng)度有關(guān)；(2)至少在理論上腫瘤細(xì)胞存在抗端粒酶抑制劑或不依賴(lài)端粒酶的端粒維持機(jī)制的可能；(3)端粒酶抑制劑對(duì)人表達(dá)端粒酶的體細(xì)胞可能有作用,例如造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、表皮基層細(xì)胞和腸腺管細(xì)胞,但這種作用可能很小,因?yàn)樾律M織的干細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞的端粒要長(zhǎng)得多。在細(xì)胞靜止期,端粒不縮短,端粒酶幾乎沒(méi)有活性。第95頁(yè)/共143頁(yè)以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究第95頁(yè)/共143頁(yè)

端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的正常細(xì)胞的作用是不同的:腫瘤細(xì)胞對(duì)端粒酶抑制劑很敏感,作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制或凋亡;

生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下,端粒長(zhǎng)度稍有縮短,然后繼續(xù)生長(zhǎng),端粒不再縮短;

干細(xì)胞與端粒酶陰性的細(xì)胞相比,其端?？s短的速度慢得多,經(jīng)端粒酶抑制劑作用后,干細(xì)胞中端粒縮短的速度有所加快,一旦去除抑制劑,端?？s短的速度又降低。

第96頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的正常細(xì)胞的作用是端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展一、以端粒酶酶RNA為靶標(biāo)通過(guò)阻斷端粒酶RNA的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑制

1、反義寡核苷酸是端粒酶抑制劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn),它是與靶RNA配對(duì)的一段短鏈DNA。按堿基配對(duì)原理與靶RNA形成雜合體,被動(dòng)和主動(dòng)地抑制RNA的轉(zhuǎn)錄。

2、核酶對(duì)端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RNA，通過(guò)催化中心的反義序列識(shí)別靶位。核酶有望成為廣譜，低毒，高效的抗癌新藥。

第97頁(yè)/共143頁(yè)端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展第97頁(yè)/共143頁(yè)二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性1、hTERT突變?cè)隗w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,hTERT突變后端粒酶活性均明顯被抑制。端粒酶抑制劑誘導(dǎo)端粒進(jìn)行性縮短,當(dāng)細(xì)胞端?？s短到臨界點(diǎn)時(shí)細(xì)胞進(jìn)入凋亡期。2、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(reversetranscriptaseinhibitors,RTI)由于端粒酶是RNA依賴(lài)的DNA聚合酶,所以RTI可以成為腫瘤治療藥物。其中對(duì)于齊多夫定的研究最多。3、靶向hTERTmRNA的ASODN

針對(duì)hTERTmRNA設(shè)計(jì)的ASODN能選擇性地與靶基因雜交,阻斷靶基因的表達(dá)。第98頁(yè)/共143頁(yè)二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性第98頁(yè)/共143頁(yè)第99頁(yè)/共143頁(yè)第99頁(yè)/共143頁(yè)第100頁(yè)/共143頁(yè)第100頁(yè)/共143頁(yè)第101頁(yè)/共143頁(yè)第101頁(yè)/共143頁(yè)第102頁(yè)/共143頁(yè)第102頁(yè)/共143頁(yè)三、G四聯(lián)體的穩(wěn)定端粒3′端突出鏈富含鳥(niǎo)苷,在體外可形成四鏈DNA結(jié)構(gòu),稱(chēng)為G四聯(lián)體。形成G四聯(lián)體后端粒酶活性受到抑制。因此,能穩(wěn)定G四聯(lián)體的藥物就可能是有效的端粒酶抑制劑。已發(fā)現(xiàn)很多此類(lèi)化合物,這些藥物可以抑制端粒酶,但尚無(wú)縮短端粒的報(bào)道。四、小分子抑制劑通過(guò)分子結(jié)構(gòu)模擬軟件進(jìn)行擬合分析，或通過(guò)其他高通量模式快速篩選端粒酶的小分子抑制劑是近年來(lái)發(fā)展較快的一個(gè)領(lǐng)域,此方法是基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)策略去搜尋先導(dǎo)化合物,用這一策略已發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)端粒酶抑制劑(例如FJ5002),但其作用機(jī)制尚不清楚。

第103頁(yè)/共143頁(yè)三、G四聯(lián)體的穩(wěn)定第103頁(yè)/共143頁(yè)Lietal,CancerRes2004;Lietal,2005;Bagherietal2006

Telomeraseknock-downincancercells

RAPIDLYinhibitscancercellgrowth

p53isnotrequiredforthis

NOtelomereuncappingorDNAdamageresponse

MetastasisisreducedHOW?RAPIDLYdownregulatescellcycleandtumorprogressiongenesGlucosemetabolismdownregulatedCelldifferentiationprograminduced?第104頁(yè)/共143頁(yè)Lietal,CancerRes2004;LiVeryshorttelomeresleadtochromosomalinstabilitybycyclesofBRIDGE–BREAKAGE–FUSION第105頁(yè)/共143頁(yè)VeryshorttelomeresleadtocAnaphasebridgesEnd-to-endfusionTelomereshortening123VIDEODicentricchromosomeinametaphasespreadofcellsfromahumanpancreaticcarcinomacellline(centromesinpink)第106頁(yè)/共143頁(yè)Anaphasebridges第107頁(yè)/共143頁(yè)第107頁(yè)/共143頁(yè)MOREcelldivisionssenescenceWithmoretelomerase,

lesslossofDNAeachcelldivision第108頁(yè)/共143頁(yè)MOREcelldivisionssenescencecell

divisionsFastersenescenceWithlesstelomerase,

morelossofDNAeachcelldivision第109頁(yè)/共143頁(yè)celldivisionsFastersenescencTelomeresandDiseaseCAD,MyocardialInfarctionDiabetesVasculardementiaObesity,insulinresistanceAlzheimersDiseaseRheumatoidArthritisBoneDensitySamanietal,Lancet,2001;Brouiletteetal,2003;ArteriosclerThrombVascBiol2003;Sampson,2006,DiabetesCare;vonZglinicki,2000,LabInvest.Jeanclosetal,2000,Hypertension;Valdesetal,.Lancet2005;Gardner,2005,Circulation;Valdesetal,2006,OsteoporosisInt.Steeretal.,2007AnnalsRheumDisease;Cawthon,2003,Lancet第110頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresandDiseaseCAD,Myoc第111頁(yè)/共143頁(yè)第111頁(yè)/共143頁(yè)ThreeMarkersofCellularAging

TelomeraseactivityTelomerelengthCellularOxidativestressPsychologicalStress,RisksofCardiovascularDiseaseandTelomeres/Telomerase/OxidativeStress第112頁(yè)/共143頁(yè)ThreeMarkersofCellularAginTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardiseaseInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).Alinkinvivo第113頁(yè)/共143頁(yè)TelomeremaintenanceInthelaInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).ChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2004*Alinkinvivo第114頁(yè)/共143頁(yè)InthelargestepidemiologicalInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastinginsulinandglucoseadipositypsychologicalstressChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2004*Alinkinvivo第115頁(yè)/共143頁(yè)InthelargestepidemiologicalInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastingglucoseadipositypsychologicalstressStresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexTelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2006Alinkinvivo第116頁(yè)/共143頁(yè)InthelargestepidemiologicalExample:Telomeraseandwhether

currentlysmokingp<.0001SmokersNon-smokersNon-smokersSmokersTelomeraseactivitypercell第117頁(yè)/共143頁(yè)Example:Telomeraseandwhethe第118頁(yè)/共143頁(yè)第118頁(yè)/共143頁(yè)第119頁(yè)/共143頁(yè)第119頁(yè)/共143頁(yè)問(wèn)題與展望

一、問(wèn)題1、檢測(cè)方法在臨床的可操作性及穩(wěn)定性；2、缺乏靈敏度和特異性高的定量準(zhǔn)確的檢測(cè)方法；3、端粒和端粒酶新組分的克隆和鑒定；4、腫瘤細(xì)胞的端粒維持及調(diào)控機(jī)制；5、端粒酶動(dòng)力學(xué)、端粒酶作用及調(diào)控的確切機(jī)制。6、部分腫瘤細(xì)胞有較長(zhǎng)的端粒（>10kb）,隨細(xì)胞有絲分裂，端?？s短是個(gè)緩慢的過(guò)程，這種情況下端粒酶抑制劑是否有效尚待進(jìn)一步證實(shí)。

第120頁(yè)/共143頁(yè)問(wèn)題與展望第120頁(yè)/共143頁(yè)二、研究展望

大量實(shí)驗(yàn)表明，端粒酶可有效地調(diào)控端粒的長(zhǎng)度，而端粒的長(zhǎng)度直接對(duì)細(xì)胞的增殖或凋亡起作用，從而決定人體壽命的長(zhǎng)短。隨著對(duì)端粒、端粒酶結(jié)構(gòu)和端粒酶激活及調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究,端粒酶與人類(lèi)衰老和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系將進(jìn)一步明確;

如何將端粒酶檢測(cè)作為腫瘤診斷標(biāo)記仍是今后研究的方向。同時(shí)進(jìn)一步探討端粒、端粒酶和衰老因素、長(zhǎng)壽因素之間的關(guān)系，以及開(kāi)展克隆人端?；虻瓤蒲姓n題對(duì)于研究人體衰老與抗衰老有著十分重要的意義。第121頁(yè)/共143頁(yè)二、研究展望第121頁(yè)/共143頁(yè)謝謝！第122頁(yè)/共143頁(yè)謝謝！第122頁(yè)/共143頁(yè)第123頁(yè)/共143頁(yè)第123頁(yè)/共143頁(yè)第124頁(yè)/共143頁(yè)第124頁(yè)/共143頁(yè)第125頁(yè)/共143頁(yè)第125頁(yè)/共143頁(yè)第126頁(yè)/共143頁(yè)第126頁(yè)/共143頁(yè)第127頁(yè)/共143頁(yè)第127頁(yè)/共143頁(yè)第128頁(yè)/共143頁(yè)第128頁(yè)/共143頁(yè)第129頁(yè)/共143頁(yè)第129頁(yè)/共143頁(yè)第三節(jié)端粒酶細(xì)胞周期中細(xì)胞增殖、凋亡的影響

一、端粒酶對(duì)細(xì)胞周期的影響

端粒酶活性與細(xì)胞周期密切相關(guān)。細(xì)胞周期所處階段不同,端粒酶活性亦不同,端粒酶活性與細(xì)胞周期CDK-CKIs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)

。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)永生化細(xì)胞株在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相都有端粒酶活性,而靜息細(xì)胞中活性降低,隨著腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G1/S期,端粒酶活性逐漸升高,在復(fù)制S期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐漸喪失,當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)血清而進(jìn)入G0期時(shí),端粒酶活性不受影響。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD或cyclinE的高表達(dá),某些周期蛋白可能參與端粒酶活性的調(diào)控。第130頁(yè)/共143頁(yè)第三節(jié)第130頁(yè)/共143頁(yè)

各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細(xì)胞DNA雙鏈破壞時(shí)可使野生型p53活化,進(jìn)而引起細(xì)胞周期停滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞得以避免表型惡性轉(zhuǎn)化。端粒雙鏈DNA的破壞是否也能活化p53依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)通路呢?kusumoto等在構(gòu)建的端粒酶和p53單或雙缺陷鼠體內(nèi)研究證實(shí),端粒DNA的丟失可以誘導(dǎo)活化p53和p21WAF1,并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，而p53的缺失則可促進(jìn)端粒序列的丟失,增大染色體的融合頻率。端粒功能的缺失以及相繼出現(xiàn)的基因不穩(wěn)定與p53缺陷相協(xié)同而激活細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。第131頁(yè)/共143頁(yè)各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細(xì)胞DNA雙鏈破壞二、端粒酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響

曾一度認(rèn)為端粒酶活性是細(xì)胞惡變或永生的標(biāo)志,然而,不但在正常組織的永生化細(xì)胞(如造血干細(xì)胞、精子),而且在非永生的、正常生理狀態(tài)下增殖活躍的細(xì)胞(如受抗原刺激的T及B淋巴細(xì)胞、口腔和食道粘膜上皮、皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮、小腸上皮)也可檢出端粒酶活性。但Lehner等用定量RT-PCR法在子宮內(nèi)膜癌、增生期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜及萎縮性子宮內(nèi)膜檢測(cè)到hTERTmRNA表達(dá)值差異顯著?？梢?jiàn),不同增殖程度的子宮內(nèi)膜均表達(dá)端粒酶活性,但其程度不同。因此,借助端粒酶定性檢測(cè)判斷良惡性增殖,其意義明顯不如定量檢測(cè)。第132頁(yè)/共143頁(yè)二、端粒酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響第132頁(yè)/共143頁(yè)

已有多次報(bào)道:改變實(shí)驗(yàn)條件可使多種端粒酶活性陰性細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性,并獲得永生;反之,抑制某些增殖活躍組織的端粒酶活性能抑制細(xì)胞增殖。另有人發(fā)現(xiàn):端粒酶通過(guò)調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度和生長(zhǎng)促進(jìn)因子基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞增殖

。提示端粒酶是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖中的重要機(jī)制。

第133頁(yè)/共143頁(yè)已有多次報(bào)道:改變實(shí)驗(yàn)條件可使多種端粒酶活性

但少數(shù)永生化的腫瘤細(xì)胞株和一些軟組織腫瘤雖然沒(méi)有端粒酶活性,但仍有較長(zhǎng)端粒,提示還存在不依賴(lài)端粒酶的端粒延長(zhǎng)機(jī)制。此外用識(shí)別hTR3′端不同序列的三種核酶作用于腫瘤細(xì)胞,4周內(nèi)端粒酶活性降低,端?？s短,增殖速度沒(méi)有改變。其他研究如黑素瘤細(xì)胞,8周內(nèi)端粒酶活性降低,但是傳代超過(guò)20代后,端粒長(zhǎng)度不縮短,細(xì)胞持續(xù)增殖。說(shuō)明除了端粒、端粒酶引起細(xì)胞增殖的作用外，還有其他引起細(xì)胞的增殖機(jī)制。第134頁(yè)/共143頁(yè)但少數(shù)永生化的腫瘤細(xì)胞株和一些軟組織腫瘤雖然三、端粒酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

啟動(dòng)凋亡的某些基因位于端粒結(jié)構(gòu)附近,完整的端粒結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達(dá),而維持端粒長(zhǎng)度主要依賴(lài)于端粒酶。

Holt等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),通過(guò)異位表達(dá)端粒酶,而使端粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定的某些正常細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力增強(qiáng)；用實(shí)驗(yàn)方法使端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞端粒延長(zhǎng),子代細(xì)胞生存和抗凋亡能力將增強(qiáng)；端粒酶陽(yáng)性永生化細(xì)胞要比端粒酶陰性永生化細(xì)胞有更強(qiáng)的抗凋亡生存能力。這些與兩個(gè)主要的凋亡途徑—核內(nèi)鈣依賴(lài)核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)途徑和Caspese家族中IL-1B轉(zhuǎn)換酶活化途徑存在缺陷有關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)hTERT顯性突變,降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性端粒酶活性,腫瘤細(xì)胞端粒將持續(xù)縮短,繼之異常有絲分裂增多,并最終出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。第135頁(yè)/共143頁(yè)三、端粒酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響第135頁(yè)/共143頁(yè)謝謝！第136頁(yè)/共143頁(yè)謝謝！第136頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段重復(fù)串聯(lián)的DNA序列與端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；端粒具有穩(wěn)定染色體,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長(zhǎng)而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降并導(dǎo)致衰老。第137頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第138頁(yè)/共143頁(yè)伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第1Telomeresarepackagedintoauniquestructure--aT-loop第139頁(yè)/共143頁(yè)TelomeresarepackagedintoaTelomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.細(xì)胞分裂端粒閾值第140頁(yè)/共143頁(yè)Telomeraseactivityisrepress第141頁(yè)/共143頁(yè)第141頁(yè)/共143頁(yè)第142頁(yè)/共143頁(yè)第142頁(yè)/共143頁(yè)問(wèn)題與展望

一、問(wèn)題1、檢測(cè)方法在臨床的可操作性及穩(wěn)定性；2、缺乏靈敏度和特異性高的定量準(zhǔn)確的檢測(cè)方法；3、端粒和端粒酶新組分的克隆和鑒定；4、腫瘤細(xì)胞的端粒維持及調(diào)控機(jī)制；5、端粒酶動(dòng)力學(xué)、端粒酶作用及調(diào)控的確切機(jī)制。6、部分腫瘤細(xì)胞有較長(zhǎng)的端粒（>10kb）,隨細(xì)胞有絲分裂，端粒縮短是個(gè)緩慢的過(guò)程，這種情況下端粒酶抑制劑是否有效尚待進(jìn)一步證實(shí)。

第143頁(yè)/共143頁(yè)問(wèn)題與展望第143頁(yè)/共143頁(yè)會(huì)計(jì)學(xué)144端粒端粒酶第1頁(yè)/共143頁(yè)會(huì)計(jì)學(xué)1端粒端粒酶第1頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段重復(fù)串聯(lián)的DNA序列與端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；端粒具有穩(wěn)定染色體,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長(zhǎng)而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降并導(dǎo)致衰老。第2頁(yè)/共143頁(yè)端粒端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由

端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸－蛋白復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的RNA為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定性。許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、癌變、凋亡、衰老。

第3頁(yè)/共143頁(yè)端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。第3頁(yè)/第4頁(yè)/共143頁(yè)第4頁(yè)/共143頁(yè)●端粒的發(fā)現(xiàn)

1938MullerX-rayDrosophila

末端極少發(fā)生缺失和倒位推測(cè)染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為T(mén)elomere

1938B.McClintock

頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。推測(cè)染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。七十年代端粒分子組成確定八十年代端粒酶的發(fā)現(xiàn)九十年代端粒酶與細(xì)胞衰老、癌癥的關(guān)系二零零九年諾貝爾獎(jiǎng)第5頁(yè)/共143頁(yè)●端粒的發(fā)現(xiàn)1938Muller末端極少發(fā)生缺失和伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第6頁(yè)/共143頁(yè)伊麗莎白?布蘭克波恩、卡羅爾?格雷德、杰克?紹斯塔第6端粒的結(jié)構(gòu)與功能第7頁(yè)/共143頁(yè)端粒的結(jié)構(gòu)與功能第7頁(yè)/共143頁(yè)第8頁(yè)/共143頁(yè)第8頁(yè)/共143頁(yè)ChromosomeDNAGene1Gene2TelomeresTelomeresTTAGGG第9頁(yè)/共143頁(yè)ChromosomeDNAGene1Gene2Telom第10頁(yè)/共143頁(yè)第10頁(yè)/共143頁(yè)1.端粒的組成

端粒DNA與端粒結(jié)合蛋白端粒DNA

重復(fù):

端粒DNA由高度重復(fù)短核苷酸序列組成。人：-TTAGGG-重復(fù)序列

保守：