流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)課件

流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)

11/14/20221一、組織培養(yǎng)概況（一）組織培養(yǎng)定義組織或細(xì)胞培養(yǎng)是指從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)。11/14/20222（二）、組織培養(yǎng)的原理

組織培養(yǎng)主要是為病毒易感的組織細(xì)胞提供一個(gè)良好的生存環(huán)境，使細(xì)胞對(duì)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，獲得生長(zhǎng)繁殖的能力。病毒在敏感細(xì)胞中繁殖，常可引起細(xì)胞代謝等方面的變化，可出現(xiàn)細(xì)胞病變并釋放病毒到維持液中，這種情況可用細(xì)胞病變、色變法及檢測(cè)維持液中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。有些病毒不引起細(xì)胞病變，有些在核內(nèi)繁殖不易釋放到維持液中，前者可用干擾的方法及免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)病毒，后者常采用凍融破壞細(xì)胞獲得病毒后檢測(cè)。

11/14/202232、單細(xì)胞的制備（略）

11/14/202253．細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：（1）細(xì)胞接種數(shù)：細(xì)胞量越大繁殖的速度越快，接種傳代細(xì)胞一般為10—30萬(wàn)/ml。（2）合成培養(yǎng)液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagle’sMEM。不同培養(yǎng)液各有其特點(diǎn)，但往往也適用于各種細(xì)胞培養(yǎng)，其主要成分為氨基酸、碳水化合物、維生素、無(wú)機(jī)鹽及其他成分。配制培養(yǎng)液的水一般用單蒸后的去離子水。合成培養(yǎng)液中不含蛋白質(zhì)成分，血清蛋白對(duì)組織培養(yǎng)是不可缺少的；不僅能促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)且能幫助細(xì)胞貼壁，不同血清對(duì)細(xì)胞促進(jìn)作用不同，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以56℃30分鐘滅活處理。含有10%血清的培養(yǎng)液能促進(jìn)細(xì)胞增殖，稱(chēng)為生長(zhǎng)液。

11/14/20226（3）酸堿度：細(xì)胞生長(zhǎng)最適宜的PH范圍是7.0–7.4。培養(yǎng)環(huán)境偏酸較偏堿更宜于細(xì)胞貼壁。PH的變化主要取決于，HCO3-濃度、二氧化碳分壓，細(xì)胞糖代謝能力。使用二氧化碳培養(yǎng)箱，能提供穩(wěn)定的5%二氧化碳。可自動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝引起的PH改變。（4）溫度：細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度與細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物體溫一致，溫度增加2–3℃對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24h內(nèi)死亡。低溫對(duì)細(xì)胞影響較小。

11/14/20227（5）無(wú)菌條件：細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一是要有無(wú)菌概念，要防止污染。在細(xì)胞培養(yǎng)中，可能發(fā)生污染的來(lái)源很多，有組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身、空氣等。因此要對(duì)培養(yǎng)液、器皿用具、操作室進(jìn)行徹底消毒，在操作時(shí)要嚴(yán)格實(shí)行無(wú)菌操作。（6）培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對(duì)于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)影響很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類(lèi)。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡過(guò)夜、清水洗10次后再用蒸餾水洗2次，烤干備用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小時(shí)后，清水洗凈再用1NHCl浸泡1小時(shí)，用清水洗后再用蒸餾水漂洗。37℃干燥后，紫外線照射消毒。

11/14/20228二、組織培養(yǎng)分離流感病毒流感監(jiān)測(cè)最主要的目的是及時(shí)發(fā)現(xiàn)并分離到有意義的流感病毒新變種，尤其大流行株，用于診斷試劑的制備、疫苗的生產(chǎn)及疫情預(yù)報(bào)。組織培養(yǎng)技術(shù)是分離，診斷流感病毒最常用和最可靠的方法之一。

人流感病毒最初是通過(guò)雪貂分離出，但雪貂繁殖慢，量少，價(jià)錢(qián)昂貴并難飼養(yǎng)，故無(wú)法加以廣泛應(yīng)用。上世紀(jì)30年代中開(kāi)始，多用雞胚來(lái)分離流感病毒。

11/14/202210（一）MDCK細(xì)胞分離流感病毒

1、實(shí)驗(yàn)材料：

MDCK細(xì)胞（最好是早代的）Eagle氏培養(yǎng)液（日本產(chǎn)的含谷氨酰胺的以抽濾為好）Hank氏溶液0.25%胰酶和Versene消化液雙抗(青、鏈霉素)或慶大霉素和抗真菌素胎?；蛐∨Ｑ?.6%或7.5%的NaHCO3.11/14/2022122、MDCK細(xì)胞傳代（1）先把需用的Eagle’s和Versene放37℃水浴預(yù)溫，其它試劑不得放入。（2）已成片的MDCK細(xì)胞，將其生長(zhǎng)液倒掉。用Versene洗2遍。（3）把Versene與0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。（4）置37℃恒溫箱5—10min，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞與細(xì)胞間互不相聯(lián)，表明消化時(shí)間已到。如細(xì)胞仍連成片，表明消化時(shí)間未到。

（5）倒掉消化液，瓶?jī)?nèi)留少許流體，再放37℃2’–3’，取出手上輕輕拍打幾下，這時(shí)可加已配好的生長(zhǎng)液，稍加吹打即可。一般情況下，1瓶細(xì)胞傳3瓶，每2-3天需傳一代。11/14/2022143、MDCK細(xì)胞保存及復(fù)蘇MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降，故各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)液氮凍存代數(shù)較低的細(xì)胞作為種子。一般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。（1）MDCK細(xì)胞保存：將單層細(xì)胞消化分散成為單細(xì)胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亞砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，緩慢凍存：先放4℃2h，轉(zhuǎn)放–70℃4h，再轉(zhuǎn)放液氮中長(zhǎng)期保存。（2）MDCK細(xì)胞復(fù)蘇：細(xì)胞凍存管從液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，1500rpm/分離心1分鐘，棄上清、沉渣加入若干ml培養(yǎng)液，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃二氧化碳溫箱培養(yǎng)。11/14/2022154、MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒敏感性測(cè)試MDCK細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降。故MDCK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室傳20代以上時(shí)，一般需測(cè)試一下其對(duì)流感病毒的敏感性。其具體測(cè)試法：選一株對(duì)MDCK細(xì)胞較敏感的流感病毒株。在同一條件下，用早代與要測(cè)試的MDCK細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行TCLD50測(cè)定。如果測(cè)試的TCLD50比早代的低2個(gè)或以上Log,表明其對(duì)病毒的敏感性已下降，不應(yīng)再加以使用。11/14/2022165、MDCK細(xì)胞病毒接種和收獲（1）在低倍光學(xué)顯微鏡下檢查MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。（2）成片的細(xì)胞棄生長(zhǎng)液，用Hank’s液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，因牛血清中含有流感病毒非特異抑制素，會(huì)影響流感病毒的復(fù)制。（3）每瓶加入接種標(biāo)本0.5-1.0ml，輕搖細(xì)胞瓶，置35℃吸附1-2h。（4）倒掉感染液，再用Hank’s液洗1–2遍，每瓶加入3ml維持液，置33-35℃培養(yǎng)。11/14/202217（5）次日起每天檢查有無(wú)細(xì)胞病變（CPE）。CPE特征為細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或碎裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落（見(jiàn)附圖）。（6）收獲及紅細(xì)胞凝集活性（HA）檢查：當(dāng)CPE出現(xiàn)+++～++++號(hào)時(shí)進(jìn)行收獲，由于CPE無(wú)法證實(shí)就是流感病毒所造成。最后還得看維持液中是否有紅細(xì)胞凝集活性（HA），出現(xiàn)細(xì)胞凝集的為陽(yáng)性標(biāo)本，收獲所有的維持液進(jìn)行病毒鑒定，也可暫凍存之。由于維持液中無(wú)牛血清，同時(shí)含一定量的胰酶和NaHCO3，故不應(yīng)在4℃保存，否則易造成HA活性丟失和PH