常用蛋白還原劑和變性劑

時(shí)間：二時(shí)間：二。二一年七月二十九日時(shí)間：二O二一年七月二十九日1．DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（Dithiothreitol,簡(jiǎn)稱為DTT），是蘇糖醇的C-1及C—4位羥基置換成巰基的化合物.在生化反應(yīng)中用做還原劑,呵護(hù)卵白質(zhì)或酶中的巰基不致氧化而失活.也經(jīng)常使用于還原卵白質(zhì)分子中的二硫鍵等.DTT是一種小分子有機(jī)還原劑，化學(xué)式為C4H1002s2.其還原狀態(tài)下為線性分子,被氧化后釀成包括二硫鍵的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu).二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）.DTT的異構(gòu)體為二硫赤糖醇（DTE）,即DTT的C3-差向異構(gòu)體.DTT也經(jīng)常被用于卵白質(zhì)中二硫鍵的還原,可用于阻止卵白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的卵白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵.但DTT往往無法還原包埋于卵白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不成及）的二硫鍵,這類二硫鍵的還原經(jīng)常需要先將卵白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑,如6M鹽酸胍、8M尿素或1%SDS）.反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的分歧,可以判斷其包埋水平的深淺.2.B-巰基乙醇英文名稱：B-Mercaptoethanol,化學(xué)式：HOCH2CH2SH,分子量：78.13,是一種具有特殊臭味的無色透明液體,易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機(jī)溶劑.B-巰基乙醇（又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、B-硫醇代乙醇）是一種有機(jī)化合物,其化學(xué)式為HOCH2CH2SH,英文通用縮寫為ME或B-ME.它兼具乙二醇（H0CH2CH20H）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團(tuán),為揮發(fā)性液體,具有較強(qiáng)烈的安慰性氣味.8-帆￡通經(jīng)常使用于二硫鍵的還原,可以作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的抗氧化劑.它被廣泛使用的原因是它的羥基使它能夠溶解于水中,而且降低它的揮發(fā)性.由于具有較低的蒸汽壓,它的難聞的情況比起惡臭的硫醇要好很多.2-巰基乙醇可以翻開卵白質(zhì)中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SHf2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH,二硫鍵被翻開后可以使卵白質(zhì)的四級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞.由于2-巰基乙醇能夠翻開卵白質(zhì)的結(jié)構(gòu),它經(jīng)常被用于卵白質(zhì)分析.而2-巰基乙醇也經(jīng)常被用于呵護(hù)卵白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會(huì)毛病形成二硫鍵.作為還原劑,2-巰基乙醇經(jīng)?？梢耘c二硫蘇糖醇（DTT）或三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）互換使用.2-巰基乙醇是少數(shù)幾種被發(fā)現(xiàn)可以延長(zhǎng)小鼠壽命的化合物.在微克量級(jí)水平上,2-巰基乙醇被觀察到對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠的生命具有多種可能的正面效應(yīng).3.TCEP化學(xué)名稱：三（2-羧乙基）膦；英文名稱：Tris（2-carboxyethyl）phosphine（TCEP）；分子量：250.19.無色透明液體,不溶于脂肪烴,微溶于水,溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲苯等,能與氯仿及四氯化碳混溶,與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維素、聚氯乙烯、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好.TCEP是一種非常有效的硫醇類還原劑,廣泛用作卵白質(zhì)化學(xué)及卵白質(zhì)組學(xué)研究中二硫鍵的定量還原劑.該試劑在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解性都很好.在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性也不錯(cuò).與其他類另外硫醇類還原劑如DTT相比,TCEP不單是一種高效的二硫鍵還原劑,而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除失落.因而在卵白質(zhì)化學(xué)及卵白質(zhì)組學(xué)研究經(jīng)常優(yōu)先選擇TCEP.TCEP在很寬的PH值范圍內(nèi)都可以選擇性定量地還原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化合物.通常室溫下反應(yīng)不到5分鐘就可以完成.TCEP沒有難聞的氣味,而且在空氣中不怕氧化.彌補(bǔ)：DTT,beta-巰基乙醇,TCEP等是巰基類還原劑.還原劑可以呵護(hù)卵白質(zhì)上自由的巰基不被氧化,從而防止卵白質(zhì)的聚集或變性.在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中,一般使用的還原劑工作濃度是1~10mM.beta-巰基乙醇是上述三種還原劑中還原能力最差的一個(gè)，因?yàn)樗约褐挥幸粋€(gè)巰基.它的效果一般只能維持2－3天.因此,在實(shí)驗(yàn)中要每隔2—3天補(bǔ)加一次beta-巰基乙醇來維持它的作用.由于beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此,可以在池液中加入beta-巰基乙醇,利用它的揮發(fā)擴(kuò)散到液滴中去.二硫蘇糖醇DTT有兩個(gè)巰基基團(tuán),其作用能維持3—7天.DTT的揮發(fā)性不像beta-巰基乙醇那么強(qiáng),所以使用時(shí)應(yīng)該直接加入到懸滴中去.DTT還可以通過微透析的方法加入.TCEP的還原能力比beta-巰基乙醇和DTT者B強(qiáng),它的作用可以維持2—3周.TCEP能使結(jié)晶用的緩沖液酸化.與DTT類似,TCEP需要直接加入到懸滴中,因此可以考慮微透析法.beta-巰基乙醇,DTT,和TECP的作用機(jī)制可能分歧.像其他添加劑一樣,如果你發(fā)現(xiàn)一類物質(zhì)對(duì)樣品的穩(wěn)定性和結(jié)晶有利,則可以去篩選這一類物質(zhì)中最適合你的樣品的一種.我們建議是,最好這三種還原劑都檢驗(yàn)考試一下,去發(fā)現(xiàn)最適合的.還原劑可以與金屬離子結(jié)合,金屬離子其被還原,而還原劑的作用被抑制.這就使得用重金屬原子作同晶置換法遇到了麻煩.可以使用EDTA來防止還原劑被金屬離子抑制.可是,如果金屬離子是你的樣品卵白維持活性所必需的,就要小心使用EDTA了.堿性條件下,beta-巰基乙醇和TECP更穩(wěn)定,效果要好于DTT.酸性條件下,TCEP的穩(wěn)定性也要好過DTT.DTT可以使Ni被還原，因此在用Ni柱純化His標(biāo)簽的卵白時(shí)要防止使用DTT,而應(yīng)該考慮beta-巰基乙醇和TECP.半胱氨酸也是一種還原劑.在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中,半胱氨酸局限性很明顯,那是由于它容易形成六角形的晶體.可是,半胱氨酸是一種有效的添加劑,能帶來明顯的效果,不外需要銘記它的局限性.如果預(yù)期到卵白會(huì)被氧化,從制備樣品開始就要加入還原劑,而且在整個(gè)流程中要不竭補(bǔ)加保證其效果.在懸滴法中,可以在池液里加入還原劑,利用還原劑的揮發(fā)擴(kuò)散,保證懸滴中還原性的環(huán)境.在確定還原劑和樣品比例時(shí),需要考慮樣品上自由巰基的數(shù)目和樣品濃度.自由巰基數(shù)目越多,樣品濃度越高,還原劑的用量就越年夜.含砷化合物與還原劑不能共用.二甲胂和二甲胂酸鈉是結(jié)晶中常使用的含砷化合物,它們不能與還原劑共同使用.其他不能與還原劑一起使用的物質(zhì)還包括：硝酸銨,過氧化氫,高氯酸鉀,硝酸鈉.在使用某種物質(zhì)之前,應(yīng)該先查閱MaterialSafetyDataSheet(MSDS).4.SDSSDS是一種陰離子去污劑,它能破壞卵白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵.在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下,卵白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被翻開并解聚成多肽鏈.解聚后的卵白質(zhì)分子與SDS充沛結(jié)合形成帶負(fù)電荷的卵白質(zhì)-SDS復(fù)合物,復(fù)合物所帶的負(fù)電荷年夜年夜超越了卵白質(zhì)分子原有的電荷量,這就消除分歧卵白質(zhì)分子之間原有的電荷不同,卵白質(zhì)-SDS復(fù)合物在溶液中的形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒.SDS不單可以分離鑒定卵白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率年夜小測(cè)定卵白質(zhì)亞基的分子量.DTT和巰基乙醇相比，作用相似，但DTT的安慰性氣味要小很多,毒性也比巰基乙醇低很多.而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時(shí)，兩者效果相近.但DTT價(jià)格略高一些.DTT有兩個(gè)巰基集團(tuán),巰基乙醇只有一個(gè)巰基集團(tuán).經(jīng)常使用卵白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度(4?8mol/L)水溶液時(shí)能斷裂氫鍵，從而使卵白質(zhì)發(fā)生分歧水平的變性.同事,還可以通過增年夜疏水基酸性殘基在水相中的溶解度,降低疏水相互作用.在室溫下4~6mol/L尿素和3~4mol/L鹽酸胍,可使球狀卵白質(zhì)從天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變至變性狀態(tài)的中點(diǎn),通常增加變性劑濃度可提高變性水平,通常8mol/L尿素的變性能力強(qiáng).一些球狀卵白質(zhì)，甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全變性,然而在8mol/L鹽酸胍溶液中，他們一般以無規(guī)則卷曲(完全變性)構(gòu)象狀態(tài)存在.尿素和鹽酸胍引起的變性包括兩種機(jī)制：1、變性卵白質(zhì)能與尿素和鹽酸胍優(yōu)先結(jié)合,形成變性卵白質(zhì)-變性劑復(fù)合物,當(dāng)復(fù)合物被除去,從而引起NfD反應(yīng)平衡向右移動(dòng).隨著變性劑濃度的著呢國(guó)家,天然狀態(tài)的卵白質(zhì)不竭轉(zhuǎn)釀成復(fù)合物,最終招致卵白質(zhì)完全變性.然而,由于變性劑與變性卵白的結(jié)合是非常弱的.因此,只有高濃度的變性劑才華引起卵白質(zhì)完全變性；2、尿素與鹽酸胍對(duì)誰說氨基酸殘基的增溶作用.因?yàn)槟蛩睾望}酸胍都具有形成氫鍵的能力,當(dāng)他們?cè)诟邼舛葧r(shí),可以破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu),結(jié)果尿素和鹽酸胍就成為非極性殘基的較好溶劑,使之卵白質(zhì)分