肥胖對肺功能和肺部炎癥的影響

兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室支持作者簡介：葉澤慧（1987-），女，碩士研究生，主要從事兒童哮喘的研究，聯(lián)系電話E-mail：yeyu19870313@126.com*通信作者：黃英，電話E-mail：huangying62@126.com肥胖對肺部炎癥和肺功能的影響葉澤慧1，黃英1，肖曉秋2，劉丹2，陳笑宜2，黃道超2，趙麗2（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心；2.兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶400014）[摘要]目的探討肥胖對小鼠肺部炎癥及肺功能的影響。方法：建立肥胖小鼠模型，雄性ICR小鼠母乳喂養(yǎng)21天離乳，隨機(jī)分為高脂組與對照組，分別給予高脂與標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)150天。將高脂組中介于正常體重的10%-20%定義為超重組，超過正常體重的20%定為肥胖組。進(jìn)行基礎(chǔ)肺功能測定，肺組織HE染色、巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記抗原F4/80免疫組化。結(jié)果：(1)肺組織HE染色和免疫組化(F4/80)示肥胖組支氣管周圍、肺泡間隔炎性細(xì)胞浸潤較正常組、超重組明顯增多，以巨噬細(xì)胞增多為主。(2)肥胖組肺功能測定示PIF、PEF、EF50相對于正常組和超重組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論：肥胖可促進(jìn)肺部炎性細(xì)胞浸潤，但對通氣功能影響較小。[關(guān)鍵詞]肥胖；肺；炎癥；肺功能[中國法分類號]R332;R589.2[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]ATheeffectofobesityonpulmonaryinflammationandfunctionYeZehui1,HuangYing1,XiaoXiaoqiu2,LiuDan2,ChenXiaoyi2,HuangDaochao2,ZhaoLi2(1DepartmentofRespiratoryDisease,TheChildren’sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014;2MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016)[Abstract]Objective：Todetecttheeffectofobesityonpulmonaryinflammationandfunctioninmice.Methods:MaleICRmicewerefedwithhighfatdietafterweaningatpostnatalday21untiltheageof150daystoestablishobesemicemodel,thecontrolgroupweregivenstandardchowdiets.Overweightgroupwereheavierthan10%-20%ofnormalgroup;Obesitygroupwereheavierthan20%ofnormalweight.Thebaselungfunctionwasrecorded,pathologicalH&Estainingandimmunohistochmistrylabelingmacrophages(F4/80)wereperformedtomeasurelunginflammation.Results:(1)PathologicalH&Estainingandimmunohistochmistryoflungsshowedobesitysignificantincreaseinfiltratedinflammatorycells(especiallymacrophages)aroundbronchusandintheinterstitium.(2)Pulmonaryfunction(PIF,PEF,EF50)showednosignificantdifferencebetweenthesegroups.Conclusions:Obesityenhancedlunginflammation,howevermadenodifferenceonairwayventilationfunction.[Keywords]:obesity;lung;inflammation;pulmonaryfunction肥胖已成為世界上一種重要的代謝疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。肥胖不僅影響體形，而且與心血管病、高血壓、糖尿病、腫瘤及關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展均有密切關(guān)系。除此之外，肥胖患者中伴有呼吸異常的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常體重者，提示肥胖與呼吸功能存在一定聯(lián)系。但到目前為止，肥胖和呼吸功能異常的確切關(guān)系及機(jī)制仍不明確。肥胖對呼吸功能的影響可能涉及呼吸系統(tǒng)多個環(huán)節(jié)，具體表現(xiàn)在肺容量、通氣功能和彌散功能等方面，這些環(huán)節(jié)的變化主要是通過脂肪組織在氣道、膈肌、胸壁堆積的增加引起的。國內(nèi)外已有的研究表明在去除機(jī)械性因素的影響外，肥胖仍能加重呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。近年來，肥胖與慢性系統(tǒng)性炎癥的關(guān)系日益受到學(xué)者們的重視[1]，而這種全身炎癥狀態(tài)是否對局部肺組織產(chǎn)生一定影響，這正是本研究的目的。材料和方法1.1動物模型的建立（1）動物模型的建立：雄性ICR小鼠母乳喂養(yǎng)21天后，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組和高脂飼料組。高脂組(18只)給予高脂飼料喂養(yǎng)150天，介于正常體重的10%-20%定義為超重組(10只)，超過正常體重的20%定為肥胖組（8只）[2]；對照組(9只)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)150天。(2)飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，高脂飼料成分：蛋白質(zhì)占24%，碳水化合物占41%，脂肪占24%；標(biāo)準(zhǔn)飼料成分：蛋白質(zhì)占19.2%，碳水化合物占67.3%，脂肪占4.3%?；A(chǔ)肺功能測定采用Emka動物肺功能儀檢測小鼠基礎(chǔ)肺功能。將清醒、自由活動狀態(tài)下的小鼠置于全身體積描計(jì)箱內(nèi)，待小鼠穩(wěn)定后，連續(xù)監(jiān)測5min肺功能各項(xiàng)指標(biāo)的變化（PEF：最大呼氣流速；PIF：最大吸氣流速；EF50：呼出50%潮氣量時呼氣流速）。數(shù)據(jù)分析由emkaTECHNOLOGIESiox軟件完成。動物的處置小鼠仰臥，分離頸部組織，暴露氣管，結(jié)扎左側(cè)支氣管，留置針行氣管插管，PBS（0.01M）0.5ml緩慢注入，保留片刻后回收，灌洗3次，混合置于EP管中。4℃，1500r/min，10min離心，沉渣用于細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，重懸后吸取懸浮液涂片，瑞士染色后計(jì)數(shù)200個細(xì)胞中各種炎癥細(xì)胞比例。分離左上葉肺組織，4%多聚甲醛溶液固定一周，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋、切片，片厚5μm，置56℃烘箱中烤12h。肺組織病理切片（HE染色）石蠟切片行蘇木精—伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤情況。每張切片在顯微鏡下放大200倍，隨機(jī)選取橫斷面較圓、直徑100-200μm完整支氣管橫截面進(jìn)行觀察。肺組織免疫組化（F4/80）切片脫蠟至水，枸櫞酸溶液微波修復(fù)，自動冷卻，PBS液漂洗3×3min。3%H2O2溶液室溫孵育20min，PBS液漂洗3×3min；10%封閉用山羊血清37℃孵育30min，PBS液漂洗3×3min。滴加一抗(抗F4/80抗體滴度1:100)，4℃孵育過夜。室溫復(fù)溫45min，PBS液漂洗3×3min；滴加生物素化二抗37℃孵育30min，PBS液漂洗3×3min；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(橙色液體)室溫孵育20min，PBS液漂洗3×3min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察顯色情況。陰性對照采用PBS液取代一抗，其余步驟同上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)表示，結(jié)果以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.01作為檢驗(yàn)的差異具有極顯著性意義，P<0.05作為檢驗(yàn)的差異具有顯著性意義。結(jié)果2.1體質(zhì)量評價高脂飼料喂養(yǎng)150天后，體重明顯增加，根據(jù)體重的差異分為超重組、肥胖組，體重分別為(45.57±0.42)g、(52.93±0.67)g；標(biāo)準(zhǔn)飼料組體重為(39.54±0.60)g，各組間差異具有極顯著性意義(P<0.01)。超重組體重介于正常體重的10%-20%之間，肥胖組體重高于正常組體重20%以上，見圖1。2.2基礎(chǔ)肺功能由圖可見，隨著體重的增加PIF、PEF、TEF50呈逐漸降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見圖2。圖1.小鼠體重圖2小鼠基礎(chǔ)肺功能測定2.3肺組織基本病理形態(tài)肺組織病理切片HE染色(圖3)，從圖中可以看出，肥胖組肺泡間隔及支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤較超重組、正常組明顯增加。AB圖3肺組織病理切片HE染色(×200)AB（A組：正常組;B組：超重組；C組：肥胖組）2.4免疫組化（F4/80）肺組織巨噬細(xì)胞表面特異性抗原F4/80免疫組化(圖4)，由圖可見，肥胖組肺泡間隔及支氣管周圍巨噬細(xì)胞陽性率較超重組、正常組明顯增加。AB圖4肺組織免疫組化F4/80(×200)AB（A組：正常組;B組：超重組；C組：肥胖組）A2.5肥胖灌洗液細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)A肥胖組細(xì)胞總數(shù)較超重組、正常組明顯增加，以巨噬細(xì)胞增多為主，見表1。表1肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)與分類計(jì)數(shù)正常組（n=9）超重組（n=10）肥胖組（n=8）細(xì)胞總數(shù)×105/ml3.16±0.183.92±0.13*7.80±0.3**巨噬細(xì)胞/200個133.22±2.68148.20±2.73*168.38±3.28**淋巴細(xì)胞/200個66.44±2.7851.2±2.81*31.00±3.13**中性粒細(xì)胞/200個0.33±0.240.60±0.220.75±0.25嗜酸性粒細(xì)胞/200個000備注：*表示超重組與正常組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；**表示肥胖組與超重組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。3．討論隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，肥胖的發(fā)生率逐漸升高，全球有超過16億的成年人超重（BMI>25kg/m2），其中4億成年人達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)（BMI>30kg/m2）[3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2015年，全球有23億人超重，中國7億人口將達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)[4]。1997年，世界衛(wèi)生組織(WHO)已明確宣布肥胖為一種疾病。肥胖不僅與心血管疾病、代謝性疾病、高凝狀態(tài)、腫瘤相關(guān)，還與許多呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥、慢性阻塞性肺病和哮喘等。目前國內(nèi)外單純性肥胖對肺功能研究較少且差異很大，對肺部炎癥更是鮮有涉及。近年來，肥胖與慢性輕度炎癥的關(guān)系日益受到學(xué)者們的重視，人類和小鼠肥胖個體的脂肪組織處于慢性炎癥狀態(tài)[4]，這里的炎癥不是我們常見以“紅腫熱痛”為特征的急性炎癥，而是亞臨床、慢性、全身性低度炎癥。通過飲食誘導(dǎo)肥胖可導(dǎo)致肺泡擴(kuò)大與肺容量相關(guān)肺泡表面區(qū)域等改變；Gotz[6]等研究表明高脂飲食能增加肺泡灌洗液淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞含量，并且發(fā)現(xiàn)肥胖持續(xù)時間與肺部炎癥有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)從組織病理學(xué)方面研究肥胖對肺部炎癥的影響，結(jié)果表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖能夠促進(jìn)小鼠肺部炎癥細(xì)胞的浸潤以及肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)含量，超重組炎性細(xì)胞也有所增加，但明顯少于肥胖組。由此表明，體重與肺部炎癥的浸潤密切相關(guān)，隨著體重的增加與肥胖持續(xù)時間的延長，肺部炎癥也呈逐漸增加趨勢。肥胖主要的病理生理改變是脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、細(xì)胞體積增大以及脂肪組織內(nèi)大量巨噬細(xì)胞浸潤，在肥胖小鼠肺組織中是否也存在與脂肪組織相同的變化，目前尚不十分明確。Lumeng[7]等發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖所導(dǎo)致的慢性炎性反應(yīng)以巨噬細(xì)胞聚集為主；Odegaard[8]等研究表明缺乏炎性蛋白的小鼠主要靠巨噬細(xì)胞促進(jìn)全身炎癥及肥胖。巨噬細(xì)胞廣泛分布于肺泡及支氣管表面，在支氣管肺泡灌洗液中占90%以上[9]。F4/80抗原是巨噬細(xì)胞特異性表面抗原，應(yīng)用F4/80抗體為標(biāo)記肺組織周圍巨噬細(xì)胞提供了理想手段，通過本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)炎性細(xì)胞浸潤以巨噬細(xì)胞為主。巨噬細(xì)胞可能通過產(chǎn)生的細(xì)胞因子參與肺部炎癥的形成過程。在炎癥情況下呼吸道管腔更易狹窄、阻力更大、流速更受限，這種由肥胖導(dǎo)致的肺部炎癥是否與肺通氣功能存在相關(guān)性，因此我們進(jìn)行肺功能測定（包括最大呼氣流速、最大吸氣流速、呼出50%潮氣量時呼氣流速）研究兩者之間的關(guān)系。最大呼氣流速（肺活量）是指盡力呼氣后，從肺內(nèi)呼出的最大氣量，反應(yīng)肺一次通氣的最大能力，在一定程度上可作為肺通氣功能的指標(biāo)[10]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超重或肥胖能夠降低呼氣/吸氣流速，但相對于正常對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能與肥胖程度和持續(xù)時間相關(guān)。臨床研究同樣證實(shí)僅有小部分嚴(yán)重肥胖患者合并呼吸功能的異常，而大部分患者呼吸功能可以長時間維持在正常水平。因此在一定的肥胖程度和時間內(nèi)，機(jī)體呼吸系統(tǒng)通過代償機(jī)制維持平衡，輕、中度肥胖一般不伴有呼吸功能的異常[11，12]。肥胖可促進(jìn)肺部炎性細(xì)胞（以巨噬細(xì)胞為主）的聚集，但因肥胖系一種慢性隱匿性疾病，在一定代償范圍內(nèi)，并不引起肺功能的改變。隨著肥胖時間的延長和負(fù)面作用的不斷積累，脂肪組織在氣道周圍、膈肌、胸壁的過度堆積，超過機(jī)體呼吸系統(tǒng)的代償能力，肥胖最終會引起肺功能的改變[13]。4．結(jié)論本研究結(jié)果表明，通過高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，成功建立肥胖模型。肥胖可促進(jìn)肺泡間隙和支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤，以巨噬細(xì)胞為主；而肥胖對肺通氣功能影響較小，考慮可能與肥胖程度和肥胖持續(xù)時間相關(guān)。在臨床工作中，充分認(rèn)識肥胖對肺部炎癥的影響，積極探索和預(yù)防肥胖相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病是非常必要的。參考文獻(xiàn)RosensonRS．Effectoffenofibrateonadiponectinandinflammatorybiomarkersinmetabolicsyndromepatients[J]．Obesity(SilverSpring)，2009，17(3)：504-509．劉姝倩．肥胖的危害[J]．心肺血管病雜志，2000，19(3)：235．羅金梅，肖毅．肥胖和睡眠呼吸疾病[J]．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院報，2011，33（3）：235-238．McCleanKM，KeeF，YoungIS，etal．Obesityandthelung：1．Epidemiology[J]．Thorax，2008，63(7)：649-654．ClementK，ViguerieN，PoitouC，etal．Weightlossregulatesinflammation-relatedgenesinwhiteadiposetissueofobesesubjects[J]．FASEBJ，2004，18(14)：1657-1669．GotzAA，RozmanJ，RodelHG，etal．Comparisonofparticle-exposuretriggeredpulmonaryandsystemicinflammationinmicefedwiththeredifferentdiets[J]．ParticleandFibreToxicology，